魚與熊掌皆可兼得–Pacbio定序原理淺談
Pacific Biosciences of California (PACB) 是一家成立於2004年的生物技術公司，總部位於美國加州門洛帕克(Menlo park)，主要進行基因定序儀器的開發和製造。該公司於2020年10月5日發表旗下最新一代的定序儀器–Sequel® IIe System，提高了儀器的運算效率和新增原機數據處理功能，提供更快速與更經濟的長讀序定序工具。
Pacbio特有的Single Molecule, Real-Time (SMRT) 定序技術，是Sequel® IIe System定序平台的核心技術，其原理是在奈米孔槽 ( zero-mode waveguide, ZMW) 中，持續偵測單一DNA polymerase聚合過程中所使用的螢光標記鹼基訊號，實現單分子即時監控的定序反應。ZMW由於結構的特殊性，使得系統只偵測位於ZMW底部的螢光訊號，大幅降低背景螢光訊號的干擾，提升定序結果的準確性 (圖一、圖二)。
圖一、在DNA polymerase合成當下使用的dye-labelled nucleotide才會進入ZMW偵測區域。
圖二、即時監控dye-labelled nucleotide合成過程的螢光訊號，搭配ZMW偵測技術，可有效降低螢光訊號的背景值，並提供高準確性的數據。
此外，根據Sequel® IIe System定序模式的選擇，可進行重複定序環形library結構的Circular Consensus Sequencing (CCS) 模式，該模式提供準確率 > 99.9% 的長片段High-fidelity reads (HiFi reads)，是全球唯一提供長片段 (25kb) HiFi reads的定序技術。若要進行超長片段的定序 (> 30kb)，可使用Continuous Long Reads (CLR) 模式，提供長達100 kb的長片段讀序。
由於HiFi reads具備高正確性(>99.9%) 與長讀序(長達25 kb) 的特性，小至單核甘酸鹼基變異，大致基因體結構變異都能提供高靈敏度的偵測結果，非常適合應用於de novo基因體的組裝研究。近年來HiFi reads技術更被多個知名國際研究計畫採用，例如：Telomere-to-Telomere Consortium、Darwin Tree of Life、Human Pangenome Reference Consortium，以及Solve-RD Project等等。
2. Metzker, M. L. (2010). Sequencing technologies—the next generation. Nature reviews genetics, 11(1), 31-46.
圖爾思生物科技 / 微生物體研究中心
