09
2021．06
CRISPR-Cas9 x PacBio x Nanopore= Ace (下)
原創文章 引用請註明出處
左邊的~右邊的~各位看倌看過來!
今天這篇文章是落落長的CRISPR-Cas9應用在三代定序進行PCR-Free建庫的完結篇，(上)篇提到了Pacific Biosciences(PacBio)與Oxford Nanopore Technologies(ONT)不約而同推出了應用CRISPR-Cas9技術對目標區域直接剪切後再將定序的Adaptor選擇性的連接到目標片段的切割點進行建庫的方法，(上)篇介紹了如何設計CRISPR RNA oligonucleotides (crRNA)讓我們有興趣的目標區段可以正確地被瞄準，本篇就要來將設計出來的crRNA應用到建庫流程，接下來會同時介紹PacBio與Nanopore如何合併Cas9技術建庫以及相關應用案例喔!
其實PacBio與Nanopore利用Cas9技術進行建庫的原理非常相似， PacBio建庫流程(Fig.1)
(1) 將gDNA片斷化
(2) 遮蔽片斷化DNA的5’端及3’端，使之無法進行後續的ligation步驟
(3) 使用Cas9針對目標區段進行剪除，由於剪除下來的目標片段才具有5’ free end以及3’ free end，因此僅有經由Cas9剪除下來的DNA片段才能夠進行下一步驟的adaptor連接形成完整的SMRTbell建庫。
(4) Adaptor連接，SMRTbell建庫完成
(5) 大功告成!
(Fig.1)
而Nanopore建庫流程如Fig.2所示:
(1) 將gDNA進行片斷化
(2) 移除5’端磷酸根及形成核糖核蛋白(ribonucleoprotein, RNP)
(3) 由核糖核蛋白針對ROI (Region of interest)進行剪切，同時於3’端加入一個Adenine
(4) 針對剪切下來的ROI片段使用TA連接，將Nanopore的adaptor接上，完成建庫
(5) 打完收工!
(Fig.2)
上列描述的建庫方法都是PCR-free, 針對一些較大或複雜無法藉由PCR獲得的目標片段都是很好的擴增方法。不論是PacBio或是Nanopore官方都已經提供了詳盡的Cas9 library preparation protocol方便使用者可以遵循進行建庫:
PacBio Cas9 library preparation protocol請參照: "Procedure & Checklist – No-Amp Targeted Sequencing Utilizing the CRISPR-Cas9 System"
(https://www.pacb.com/wp-content/uploads/Procedure-Checklist-No-Amp-Targeted-Sequencing-Utilizing-the-CRISPR-Cas9-System.pdf)
Nanopore Cas9 library preparation protocol請參照: "Cas9 Sequencing Kit (SQK-CS9109)"
(https://community.nanoporetech.com/protocols/cas-sequencing-kit/checklist_example.pdf)
不同的是，PacBio protocol除PacBio本身提供的試劑耗材外，還羅列了較多的第三方試劑耗材，在實驗的準備上相較Nanopore來的麻煩許多; 而Nanopore官方推出了Cas9 Sequencing Kit---SQK-CS9109，除了crRNAs、tracrRNA以及Cas9 nuclease須依實驗要求另外訂購以外，其餘需要使用到的試劑皆包含在Cas9 Sequencing Kit，在實驗的入門門檻上提供了較高的便利性。但是在兩個平台的使用上依然都有各自的擁護者，也都有不少相關應用文獻的產出。
接下來舉例Cas9擴增在人類精神疾病應用的重要性，大家知道嗎?有>40種人類神經和神經肌肉疾病是由重複序列擴增(repeat expansions)引起的，由於複製的錯誤，重複序列擴增的DNA序列單元（短則2bp，長可達60bp）會在基因體中擴展，其重複的次數跟疾病的嚴重程度或發病年齡有高度相關，而這些重複序列擴增單元依照重複次數可能達上百kb，而這些片段檢測的難度不僅僅在於其長度極長無法使用PCR的方式獲得外，許多重複序列擴增單元甚至是高GC含量，也無法使用NGS取得很好的定序成果，諸如: 亨丁頓舞蹈症(HTT基因，CAG重複)、X染色體脆折症(FMR1基因，CGG重複)、肌萎縮性側索硬化、額顳葉性癡呆(C9orf72基因，GGGGCC重複)…等多種人類神經和神經肌肉疾病皆是著名案例。
最後分享一篇發表於Genetics in medicine，使用PacBio CRISPR-Cas9技術對X染色體脆折症的FMR1基因的CGG重複序列擴增單元進行定序的案例:
(Fig.3)
X染色體脆折症是造成智力障礙的第二主因，僅次於唐氏症，是種性聯遺傳疾病，在男性發病比例為四千分之一，而女性約為八千分之一，且常與自閉症併發，正常人CGG重複序列擴增單元約為5-40個拷貝數;pre-mutation的CGG重複序列擴增單元約為45-200個拷貝數，可無症狀；但經由女性傳到其子女時，可能會進一步CGG擴增200次以上;而X染色體脆折症患者的CGG重複序列擴增單元大於200個拷貝數(Fig.4)。
(Fig.4)
本篇研究利用PacBio CRISPR-Cas9技術擴增FMR1基因且定序完成100% GC的片段，並發現在CGG重複序列擴增單元中藏有AGG的序列 (Fig.5)。由Fig.5可看出母親若具有75次重複的CGG重複序列擴增單元時，含有0次AGG序列，遺傳X染色體脆折症給下一代的機率為80%;而含有1次AGG序列，遺傳X染色體脆折症給下一代的機率為60%;含有2次AGG序列，遺傳X染色體脆折症給下一代的機率為15%，其出現的次數顯著影響pre-mutation的母親遺傳X染色體脆折症給下一代的機率。長讀長定序揭露了FMR1基因內的序列結果，判斷X染色體脆折症遺傳給下一代的風險，不僅依靠CGG重複序列擴增單元次數，更可以藉由AGG序列的出現次數進行評斷，有別傳統方法不進行定序僅藉由觀察FMR1基因長度進行CGG重複序列擴增單元長度的推斷提供更多的資訊結果。
(Fig.5)
總而言之，言而總之~ 對於無法使用PCR進行擴增的目標區段(重複區域、高GC區域、超長目標區域…等)，使用CRISPR-Cas9技術擴增後於PacBio或是Nanopore平台上進行定序，是您的一項聰明新選擇!
參考資料
1. Procedure & Checklist – No-Amp Targeted Sequencing Utilizing the CRISPR-Cas9 System
2. Cas9 Sequencing Kit (SQK-CS9109)
3. YRIGOLLEN et al, Influence of AGG interruptions on stability of the FMR1 gene
左邊的~右邊的~各位看倌看過來!
今天這篇文章是落落長的CRISPR-Cas9應用在三代定序進行PCR-Free建庫的完結篇，(上)篇提到了Pacific Biosciences(PacBio)與Oxford Nanopore Technologies(ONT)不約而同推出了應用CRISPR-Cas9技術對目標區域直接剪切後再將定序的Adaptor選擇性的連接到目標片段的切割點進行建庫的方法，(上)篇介紹了如何設計CRISPR RNA oligonucleotides (crRNA)讓我們有興趣的目標區段可以正確地被瞄準，本篇就要來將設計出來的crRNA應用到建庫流程，接下來會同時介紹PacBio與Nanopore如何合併Cas9技術建庫以及相關應用案例喔!
其實PacBio與Nanopore利用Cas9技術進行建庫的原理非常相似， PacBio建庫流程(Fig.1)
(1) 將gDNA片斷化
(2) 遮蔽片斷化DNA的5’端及3’端，使之無法進行後續的ligation步驟
(3) 使用Cas9針對目標區段進行剪除，由於剪除下來的目標片段才具有5’ free end以及3’ free end，因此僅有經由Cas9剪除下來的DNA片段才能夠進行下一步驟的adaptor連接形成完整的SMRTbell建庫。
(4) Adaptor連接，SMRTbell建庫完成
(5) 大功告成!
(Fig.1)而Nanopore建庫流程如Fig.2所示:
(1) 將gDNA進行片斷化
(2) 移除5’端磷酸根及形成核糖核蛋白(ribonucleoprotein, RNP)
(3) 由核糖核蛋白針對ROI (Region of interest)進行剪切，同時於3’端加入一個Adenine
(4) 針對剪切下來的ROI片段使用TA連接，將Nanopore的adaptor接上，完成建庫
(5) 打完收工!
(Fig.2)
上列描述的建庫方法都是PCR-free, 針對一些較大或複雜無法藉由PCR獲得的目標片段都是很好的擴增方法。不論是PacBio或是Nanopore官方都已經提供了詳盡的Cas9 library preparation protocol方便使用者可以遵循進行建庫:
PacBio Cas9 library preparation protocol請參照: "Procedure & Checklist – No-Amp Targeted Sequencing Utilizing the CRISPR-Cas9 System"(https://www.pacb.com/wp-content/uploads/Procedure-Checklist-No-Amp-Targeted-Sequencing-Utilizing-the-CRISPR-Cas9-System.pdf)
Nanopore Cas9 library preparation protocol請參照: "Cas9 Sequencing Kit (SQK-CS9109)"(https://community.nanoporetech.com/protocols/cas-sequencing-kit/checklist_example.pdf)
不同的是，PacBio protocol除PacBio本身提供的試劑耗材外，還羅列了較多的第三方試劑耗材，在實驗的準備上相較Nanopore來的麻煩許多; 而Nanopore官方推出了Cas9 Sequencing Kit---SQK-CS9109，除了crRNAs、tracrRNA以及Cas9 nuclease須依實驗要求另外訂購以外，其餘需要使用到的試劑皆包含在Cas9 Sequencing Kit，在實驗的入門門檻上提供了較高的便利性。但是在兩個平台的使用上依然都有各自的擁護者，也都有不少相關應用文獻的產出。
接下來舉例Cas9擴增在人類精神疾病應用的重要性，大家知道嗎?有>40種人類神經和神經肌肉疾病是由重複序列擴增(repeat expansions)引起的，由於複製的錯誤，重複序列擴增的DNA序列單元（短則2bp，長可達60bp）會在基因體中擴展，其重複的次數跟疾病的嚴重程度或發病年齡有高度相關，而這些重複序列擴增單元依照重複次數可能達上百kb，而這些片段檢測的難度不僅僅在於其長度極長無法使用PCR的方式獲得外，許多重複序列擴增單元甚至是高GC含量，也無法使用NGS取得很好的定序成果，諸如: 亨丁頓舞蹈症(HTT基因，CAG重複)、X染色體脆折症(FMR1基因，CGG重複)、肌萎縮性側索硬化、額顳葉性癡呆(C9orf72基因，GGGGCC重複)…等多種人類神經和神經肌肉疾病皆是著名案例。
最後分享一篇發表於Genetics in medicine，使用PacBio CRISPR-Cas9技術對X染色體脆折症的FMR1基因的CGG重複序列擴增單元進行定序的案例:
(Fig.3)
X染色體脆折症是造成智力障礙的第二主因，僅次於唐氏症，是種性聯遺傳疾病，在男性發病比例為四千分之一，而女性約為八千分之一，且常與自閉症併發，正常人CGG重複序列擴增單元約為5-40個拷貝數;pre-mutation的CGG重複序列擴增單元約為45-200個拷貝數，可無症狀；但經由女性傳到其子女時，可能會進一步CGG擴增200次以上;而X染色體脆折症患者的CGG重複序列擴增單元大於200個拷貝數(Fig.4)。
(Fig.4)
本篇研究利用PacBio CRISPR-Cas9技術擴增FMR1基因且定序完成100% GC的片段，並發現在CGG重複序列擴增單元中藏有AGG的序列 (Fig.5)。由Fig.5可看出母親若具有75次重複的CGG重複序列擴增單元時，含有0次AGG序列，遺傳X染色體脆折症給下一代的機率為80%;而含有1次AGG序列，遺傳X染色體脆折症給下一代的機率為60%;含有2次AGG序列，遺傳X染色體脆折症給下一代的機率為15%，其出現的次數顯著影響pre-mutation的母親遺傳X染色體脆折症給下一代的機率。長讀長定序揭露了FMR1基因內的序列結果，判斷X染色體脆折症遺傳給下一代的風險，不僅依靠CGG重複序列擴增單元次數，更可以藉由AGG序列的出現次數進行評斷，有別傳統方法不進行定序僅藉由觀察FMR1基因長度進行CGG重複序列擴增單元長度的推斷提供更多的資訊結果。
(Fig.5)總而言之，言而總之~ 對於無法使用PCR進行擴增的目標區段(重複區域、高GC區域、超長目標區域…等)，使用CRISPR-Cas9技術擴增後於PacBio或是Nanopore平台上進行定序，是您的一項聰明新選擇!
參考資料
1. Procedure & Checklist – No-Amp Targeted Sequencing Utilizing the CRISPR-Cas9 System
2. Cas9 Sequencing Kit (SQK-CS9109)
3. YRIGOLLEN et al, Influence of AGG interruptions on stability of the FMR1 gene
圖爾思生物科技 / 微生物體研究中心
吳雁韻 文案
