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2021．04
【基因變異那麼多，到底要用哪個平台定序？】
原創文章 引用請註明出處
隨著精準醫療多方的應用，基因體的研究對於人類疾病解密有著相當的幫助，使得我們更了解疾病的機轉、如何預防以及更有效的治療。基因體的變異可分為單核苷酸變異 (Single nucleotide variants)、拷貝數目變異 (Copy number variants)，包含：複製 (Duplication)、缺失 (Deletion)、倒轉 (Inversion)。而當基因變異 >50 bp 時，通常會被稱為結構變異 (Structural variations)。結構變異總數雖然沒有單核苷酸變異多，但因其變異橫跨範圍大，對於疾病的影響力也不可忽視[1]。今天的文章中將分享幾篇關於不同二代/三代檢測基因變異的研究結果。
(1) #Multi-platform #PacBio #Illumina #Bionano #Indel #SV #human genome
第一篇文獻[2]主要比較 PacBio, Illumina, Bionano 偵測人體基因變異。採用的為三組不同種族的 family trios 結果，漢人 (HG00514) 與約魯班人 (NA19240) 分別代表低與高的遺傳多樣性基因體，而波多黎各人 (HG00733) 則為種族混合的代表。結果來看，各平台可以偵測到的變異趨勢與分布大致相似 (圖1A)。以偵測indel (1-49 bp) 來說，平均每個個體檢測出 818,054 個 indel。發現單使用 PacBio 平台檢測 indel 時，會遺漏許多 Illumina 平台可以檢測出的 indel (圖1C；灰-Illumina、藍-PacBio)，且無法穩定偵測 1 bp indel。相反地，若 indel 大於 15 bp 時，PacBio 比起 Illumina 有更好的檢出率，增加約 12% insertions、23% deletions 的檢出率。若以 SV (>50 bp) 來說，共檢出 27,622 個 SV。而 PacBio 平台可以檢測出的 SV，較 Illumina 平台多出約三倍，尤其是重複序列造成的 50 bp-2 Kb 結構變異 (圖1B)。研究也發現，有約 83% 的 insertions 使用二代定序檢測時會被遺漏。
【圖一】
(2) #Multi-platform #Nanopore #PacBio #Illumina#SV #cancer genome
第二篇文獻[3]主要比較 Nanopore, PacBio, Illumina 檢測癌細胞中基因變異。以 Nanopore 與 PacBio 檢測 SK-BR-3 乳癌細胞為例，Nanopore PromethION 找出的 SV 約 80% 與 PacBio 平台找到的一致 (12,392 out of 15,408 SVs)。進一步去比較可以發現，在這些結構變異中，PacBio 平台對於 insertions 檢出率較高，而 Nanopore 平台則對於 duplications 檢出率較高。若以 Nanopore 長讀長平台與 Illumina 短讀長平台去檢測 LC-2/ad 肺腺癌細胞，Nanopore 平台可以檢測出的 17,092 個 SV 當中，有 2,236 個在 Illumina 平台中也可以被找出來 (圖2A)，與先前其他文獻趨勢相似[4]。去比較 Nanopore 平台與 Illumina 平台找到的 SV，可以從 圖2B 中發現，比起 Nanopore(Sniffles)，Illumina (GenomonSV) 找到更多的translocations。若以圖2C來看 Illumina (GenomonSV) 的準確度，藍色柱狀圖的 translocation 準確度是低的，也就是說使用 Illumina (GenomonSV) 平台，雖然找到較多的 translocation 變異，但其正確性有待考量。
【圖二】
(3) #Multi-platform #Nanopore #PacBio #Illumina #10XGenomics #SV #cancer genome
第三篇文獻[5]主要比較 Nanopore, PacBio, Illumina/10x Genomics 檢測乳癌細胞與相對應正常細胞中基因變異。常見乳癌細胞株 SKBR3 及人類檢體經由不同平台定序與相對應生物資訊工具分析出 SV 並交集，流程如 圖3A。各平台間找到的結構變異交集如圖3B，為了減少短讀長定序找出的假性結構變異，先將 Illumina 與 10x Genomics 兩平台找到的變異做交集才列入結果 (藍色圈部分)，以減少偽陽性率。以交集圖來看，可以發現三代長讀長定序找到的 SV 總數約為二代定序的 4 倍左右。而就三代平台之間的比較，發現 Nanopore 平台與 PacBio 平台找到的 SV 有 90% 以上是重疊的，證實兩個平台之間發現的 SV 高度重覆性。最後，圖3C 顯示，從小至 50 bp、大至 500 Kb 的結構變異，長讀長定序可以檢出的數量都明顯較短讀長定序佳。
【圖三】
總結來說，若要偵測基因體中的變異，以單核苷酸變異來說，使用二代定序已有足夠好的檢出率。而要檢測結構變異的話，三代定序有較佳的檢出率。而 Nanopore 平台或者 PacBio 平台檢測出的變異彼此間也有高度重覆。整體而言，雖然各自有其偏好性，但關聯性是高的。
參考資料
1. Roses, Allen D., et al. "Structural variants can be more informative for disease diagnostics, prognostics and translation than current SNP mapping and exon sequencing." Expert opinion on drug metabolism & toxicology 12.2 (2016): 135-147.
2. Chaisson, Mark JP, et al. "Multi-platform discovery of haplotype-resolved structural variation in human genomes." Nature communications 10.1 (2019): 1-16.
3. Sakamoto, Yoshitaka, et al. "Long-read sequencing for non-small-cell lung cancer genomes." Genome research 30.9 (2020): 1243-1257.
4. Nattestad, Maria, et al. "Complex rearrangements and oncogene amplifications revealed by long-read DNA and RNA sequencing of a breast cancer cell line." Genome research 28.8 (2018): 1126-1135.
5. Aganezov, Sergey, et al. "Comprehensive analysis of structural variants in breast cancer genomes using single-molecule sequencing." Genome Research 30.9 (2020): 1258-1273.
隨著精準醫療多方的應用，基因體的研究對於人類疾病解密有著相當的幫助，使得我們更了解疾病的機轉、如何預防以及更有效的治療。基因體的變異可分為單核苷酸變異 (Single nucleotide variants)、拷貝數目變異 (Copy number variants)，包含：複製 (Duplication)、缺失 (Deletion)、倒轉 (Inversion)。而當基因變異 >50 bp 時，通常會被稱為結構變異 (Structural variations)。結構變異總數雖然沒有單核苷酸變異多，但因其變異橫跨範圍大，對於疾病的影響力也不可忽視[1]。今天的文章中將分享幾篇關於不同二代/三代檢測基因變異的研究結果。
(1) #Multi-platform #PacBio #Illumina #Bionano #Indel #SV #human genome
第一篇文獻[2]主要比較 PacBio, Illumina, Bionano 偵測人體基因變異。採用的為三組不同種族的 family trios 結果，漢人 (HG00514) 與約魯班人 (NA19240) 分別代表低與高的遺傳多樣性基因體，而波多黎各人 (HG00733) 則為種族混合的代表。結果來看，各平台可以偵測到的變異趨勢與分布大致相似 (圖1A)。以偵測indel (1-49 bp) 來說，平均每個個體檢測出 818,054 個 indel。發現單使用 PacBio 平台檢測 indel 時，會遺漏許多 Illumina 平台可以檢測出的 indel (圖1C；灰-Illumina、藍-PacBio)，且無法穩定偵測 1 bp indel。相反地，若 indel 大於 15 bp 時，PacBio 比起 Illumina 有更好的檢出率，增加約 12% insertions、23% deletions 的檢出率。若以 SV (>50 bp) 來說，共檢出 27,622 個 SV。而 PacBio 平台可以檢測出的 SV，較 Illumina 平台多出約三倍，尤其是重複序列造成的 50 bp-2 Kb 結構變異 (圖1B)。研究也發現，有約 83% 的 insertions 使用二代定序檢測時會被遺漏。
【圖一】
(2) #Multi-platform #Nanopore #PacBio #Illumina#SV #cancer genome
第二篇文獻[3]主要比較 Nanopore, PacBio, Illumina 檢測癌細胞中基因變異。以 Nanopore 與 PacBio 檢測 SK-BR-3 乳癌細胞為例，Nanopore PromethION 找出的 SV 約 80% 與 PacBio 平台找到的一致 (12,392 out of 15,408 SVs)。進一步去比較可以發現，在這些結構變異中，PacBio 平台對於 insertions 檢出率較高，而 Nanopore 平台則對於 duplications 檢出率較高。若以 Nanopore 長讀長平台與 Illumina 短讀長平台去檢測 LC-2/ad 肺腺癌細胞，Nanopore 平台可以檢測出的 17,092 個 SV 當中，有 2,236 個在 Illumina 平台中也可以被找出來 (圖2A)，與先前其他文獻趨勢相似[4]。去比較 Nanopore 平台與 Illumina 平台找到的 SV，可以從 圖2B 中發現，比起 Nanopore(Sniffles)，Illumina (GenomonSV) 找到更多的translocations。若以圖2C來看 Illumina (GenomonSV) 的準確度，藍色柱狀圖的 translocation 準確度是低的，也就是說使用 Illumina (GenomonSV) 平台，雖然找到較多的 translocation 變異，但其正確性有待考量。
【圖二】(3) #Multi-platform #Nanopore #PacBio #Illumina #10XGenomics #SV #cancer genome
第三篇文獻[5]主要比較 Nanopore, PacBio, Illumina/10x Genomics 檢測乳癌細胞與相對應正常細胞中基因變異。常見乳癌細胞株 SKBR3 及人類檢體經由不同平台定序與相對應生物資訊工具分析出 SV 並交集，流程如 圖3A。各平台間找到的結構變異交集如圖3B，為了減少短讀長定序找出的假性結構變異，先將 Illumina 與 10x Genomics 兩平台找到的變異做交集才列入結果 (藍色圈部分)，以減少偽陽性率。以交集圖來看，可以發現三代長讀長定序找到的 SV 總數約為二代定序的 4 倍左右。而就三代平台之間的比較，發現 Nanopore 平台與 PacBio 平台找到的 SV 有 90% 以上是重疊的，證實兩個平台之間發現的 SV 高度重覆性。最後，圖3C 顯示，從小至 50 bp、大至 500 Kb 的結構變異，長讀長定序可以檢出的數量都明顯較短讀長定序佳。
【圖三】
總結來說，若要偵測基因體中的變異，以單核苷酸變異來說，使用二代定序已有足夠好的檢出率。而要檢測結構變異的話，三代定序有較佳的檢出率。而 Nanopore 平台或者 PacBio 平台檢測出的變異彼此間也有高度重覆。整體而言，雖然各自有其偏好性，但關聯性是高的。
參考資料
1. Roses, Allen D., et al. "Structural variants can be more informative for disease diagnostics, prognostics and translation than current SNP mapping and exon sequencing." Expert opinion on drug metabolism & toxicology 12.2 (2016): 135-147.
2. Chaisson, Mark JP, et al. "Multi-platform discovery of haplotype-resolved structural variation in human genomes." Nature communications 10.1 (2019): 1-16.
3. Sakamoto, Yoshitaka, et al. "Long-read sequencing for non-small-cell lung cancer genomes." Genome research 30.9 (2020): 1243-1257.
4. Nattestad, Maria, et al. "Complex rearrangements and oncogene amplifications revealed by long-read DNA and RNA sequencing of a breast cancer cell line." Genome research 28.8 (2018): 1126-1135.
5. Aganezov, Sergey, et al. "Comprehensive analysis of structural variants in breast cancer genomes using single-molecule sequencing." Genome Research 30.9 (2020): 1258-1273.
圖爾思生物科技 / 微生物體研究中心
許瑄珉 文案
