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2021．06
【Nanopore London calling 2021】
原創文章 引用請註明出處
Nanopore一年一度的研討會London Calling (LC)，會提供大量知識包含基礎背景介紹、最新數據突破、近期更新內容、年度預計發布內容以及各知識領域的研究發表。今年的領域主要包含：人類與轉譯研究、COVID-19與遺傳流行病學、微生物與總基因體、植物與動物以及生物資訊分析等。如有興趣可以去Nanopore resource center觀看回放影片：https://nanoporetech.com/resource-centre。
接著要跟大家介紹這次演講中的幾個重點：
(1) Adaptive Sequencing
這算是Nanopore獨有的一項功能，因定序的同時可以及時偵測定序的序列，藉由快速比對序列後，利用反衝電流將不想要定序的片段吐出孔道，以利下一段序列進入孔道中進行定序。目前可應用於GridION, MinION, Mk1C。
Adaptive sequencing又可分為depletion，將已知的序列輸入進行比對，排出已知的序列不進行定序。這種方法可以增加混樣中比例較低的物種被定序到的機率。例如定序微生物混樣時，定序一段時間後，可將高比例物種的序列輸進資料庫，使得系統停止繼續定序高比例物種，增加低比例物種序列被定序的機率，以達到晶片通量的有效應用。另一種方法為enrichment，無法對應到資料庫的序列，即進行排除。例如定序人類基因體時，輸入特定癌症基因的panel序列後，即可達到targeted sequencing的效果，將想看的標的基因定序深度大大提升。這次的LC2021也介紹了adaptive sequencing mapper “UNCALLED”[1]與”ReadFish”[2]的文獻。有興趣者，附上傳送門如下：
UNCALLED：https://reurl.cc/Dgjlkj
ReadFish：https://reurl.cc/Dgjl8e
除此之外，LC2021這次的SHOWCASE也比較了罕見疾病利用WGS或adaptive sequencing方法所耗資源[3]。小胖威利症(Prader-Willi Syndrome, PWS)為遺傳性疾病，其病因可分為父源性第15號染色體有缺失、母源性單親二倍體，以及位點甲基化。運用Nanopore定序技術可涵括所有可能病因包含甲基化的直接檢測。SHOWCASE共使用兩種不同pipeline，一個是先利用小通量Flongle進行樣品品質確認後，以PromethION做WGS。另一個直接運用GridION做adaptive sequencing，發現不管是定序成本或者時間皆可大幅減少，如下圖。
(2) 試劑部分更新
1. Ligation sequencing kit LSK109升級為LSK110 LSK110已經上市一陣子，但在今年5月後即停止販售LSK109試劑，且這次的演講多使用LSK110試劑為主。兩者之間的改版差別在於用了新的adapter，使得定序過程中可定序時間增加、總產出量上升。
2. Ultra-long kit 適用於超長片段定序，目前已在販售，為最新可應用於最長片段定序使用試劑。適用於樣品製備片段大於100 kb實驗中，其最佳通量目前為PromethION 90Gb/flow cell，且N50大於100 kb。
3. Q20+ Chemistry[4] 該試劑更新包含了酵素的改良、實驗條件的調整以及優化在最新basecaller “Bonito”的basecalling model。這樣的改良使得單分子定序原始數據準確度達99%以上，也就是Q20+。Q20+ Chemistry於去年12月第一次在Nanopore演講中被提到，目前也有多位Nanopore Community用戶試用中，預計今年7月會於市面上搶先體驗。
4. Targeted sequencing kit新增了16S跟Cas9等應用。
(3) 最新數據發布 Nanopore截止於2021年5月份，將其最佳定序數據整理於webinar中。包含：應用Q20+ Chemistry使得原始數據準確度可達99.3%、合併使用R9跟Medaka/DeepVariant使得SNV偵測率達99.9%、PromethION最大定序通量達245 Gb、最長定序片段達4.2 Mb等紀錄，其餘數據呈現如下圖[5]。
(4) 生物資訊分析相關更新
1. Guppy 5 (Bonito)於今年5月份釋出於MinKnow可供使用，原始數據準確度達98.3% (Q18)。
2. “Duplex”方法的曝光，單分子定序準確度可達Q26-Q29 (接近Q30, 99.9%)[6]。
3. 分析工具適用範圍擴大：EPI2ME提供了基因體組裝、外顯子的alignment、What’s in my Pot中即時的species ID 組裝以及適用於SARS-CoV-2分析的ARTIC protocol。EPI2ME Lab增加了各種workflow的導覽教學，並更新為Nextflow reactive workflow framework[6]。
參考資料
1. Kovaka, Sam, et al. "Targeted nanopore sequencing by real-time mapping of raw electrical signal with UNCALLED." Nature Biotechnology (2020): 1-11.
2. Payne, Alexander, et al. "Readfish enables targeted nanopore sequencing of gigabase-sized genomes." Nature Biotechnology (2020): 1-9.
3. Nanopore LC2021 webinar. SHOWCASE: rare disease.
4. Nanopore official website. News: New nanopore sequencing chemistry in developers’ hands; set to deliver Q20+ (99%+) “raw read” accuracy.
5. Nanopore LC2021 webinar. Update from Oxford Nanopore Technologies.
6. Nanopore official website. News: Oxford Nanopore Tech Update: new Duplex method for Q30 nanopore single molecule reads, PromethION 2, and more.
Nanopore一年一度的研討會London Calling (LC)，會提供大量知識包含基礎背景介紹、最新數據突破、近期更新內容、年度預計發布內容以及各知識領域的研究發表。今年的領域主要包含：人類與轉譯研究、COVID-19與遺傳流行病學、微生物與總基因體、植物與動物以及生物資訊分析等。如有興趣可以去Nanopore resource center觀看回放影片：https://nanoporetech.com/resource-centre。
接著要跟大家介紹這次演講中的幾個重點：
(1) Adaptive Sequencing
這算是Nanopore獨有的一項功能，因定序的同時可以及時偵測定序的序列，藉由快速比對序列後，利用反衝電流將不想要定序的片段吐出孔道，以利下一段序列進入孔道中進行定序。目前可應用於GridION, MinION, Mk1C。
Adaptive sequencing又可分為depletion，將已知的序列輸入進行比對，排出已知的序列不進行定序。這種方法可以增加混樣中比例較低的物種被定序到的機率。例如定序微生物混樣時，定序一段時間後，可將高比例物種的序列輸進資料庫，使得系統停止繼續定序高比例物種，增加低比例物種序列被定序的機率，以達到晶片通量的有效應用。另一種方法為enrichment，無法對應到資料庫的序列，即進行排除。例如定序人類基因體時，輸入特定癌症基因的panel序列後，即可達到targeted sequencing的效果，將想看的標的基因定序深度大大提升。這次的LC2021也介紹了adaptive sequencing mapper “UNCALLED”[1]與”ReadFish”[2]的文獻。有興趣者，附上傳送門如下：
UNCALLED：https://reurl.cc/Dgjlkj
ReadFish：https://reurl.cc/Dgjl8e
除此之外，LC2021這次的SHOWCASE也比較了罕見疾病利用WGS或adaptive sequencing方法所耗資源[3]。小胖威利症(Prader-Willi Syndrome, PWS)為遺傳性疾病，其病因可分為父源性第15號染色體有缺失、母源性單親二倍體，以及位點甲基化。運用Nanopore定序技術可涵括所有可能病因包含甲基化的直接檢測。SHOWCASE共使用兩種不同pipeline，一個是先利用小通量Flongle進行樣品品質確認後，以PromethION做WGS。另一個直接運用GridION做adaptive sequencing，發現不管是定序成本或者時間皆可大幅減少，如下圖。
(2) 試劑部分更新
1. Ligation sequencing kit LSK109升級為LSK110 LSK110已經上市一陣子，但在今年5月後即停止販售LSK109試劑，且這次的演講多使用LSK110試劑為主。兩者之間的改版差別在於用了新的adapter，使得定序過程中可定序時間增加、總產出量上升。
2. Ultra-long kit 適用於超長片段定序，目前已在販售，為最新可應用於最長片段定序使用試劑。適用於樣品製備片段大於100 kb實驗中，其最佳通量目前為PromethION 90Gb/flow cell，且N50大於100 kb。
3. Q20+ Chemistry[4] 該試劑更新包含了酵素的改良、實驗條件的調整以及優化在最新basecaller “Bonito”的basecalling model。這樣的改良使得單分子定序原始數據準確度達99%以上，也就是Q20+。Q20+ Chemistry於去年12月第一次在Nanopore演講中被提到，目前也有多位Nanopore Community用戶試用中，預計今年7月會於市面上搶先體驗。
4. Targeted sequencing kit新增了16S跟Cas9等應用。
(3) 最新數據發布 Nanopore截止於2021年5月份，將其最佳定序數據整理於webinar中。包含：應用Q20+ Chemistry使得原始數據準確度可達99.3%、合併使用R9跟Medaka/DeepVariant使得SNV偵測率達99.9%、PromethION最大定序通量達245 Gb、最長定序片段達4.2 Mb等紀錄，其餘數據呈現如下圖[5]。
(4) 生物資訊分析相關更新
1. Guppy 5 (Bonito)於今年5月份釋出於MinKnow可供使用，原始數據準確度達98.3% (Q18)。
2. “Duplex”方法的曝光，單分子定序準確度可達Q26-Q29 (接近Q30, 99.9%)[6]。
3. 分析工具適用範圍擴大：EPI2ME提供了基因體組裝、外顯子的alignment、What’s in my Pot中即時的species ID 組裝以及適用於SARS-CoV-2分析的ARTIC protocol。EPI2ME Lab增加了各種workflow的導覽教學，並更新為Nextflow reactive workflow framework[6]。
參考資料
1. Kovaka, Sam, et al. "Targeted nanopore sequencing by real-time mapping of raw electrical signal with UNCALLED." Nature Biotechnology (2020): 1-11.
2. Payne, Alexander, et al. "Readfish enables targeted nanopore sequencing of gigabase-sized genomes." Nature Biotechnology (2020): 1-9.
3. Nanopore LC2021 webinar. SHOWCASE: rare disease.
4. Nanopore official website. News: New nanopore sequencing chemistry in developers’ hands; set to deliver Q20+ (99%+) “raw read” accuracy.
5. Nanopore LC2021 webinar. Update from Oxford Nanopore Technologies.
6. Nanopore official website. News: Oxford Nanopore Tech Update: new Duplex method for Q30 nanopore single molecule reads, PromethION 2, and more.
圖爾思生物科技 / 微生物體研究中心
許瑄珉 文案
