微生物 16S rRNA 全長定序服務簡介

      次世代定序 (Next-generation sequencing) 的發展使基因體研究成本大幅降低。三代定序 (Third-generation sequencing) 的出現，則解決了二代定序讀長較短的問題，使微生物研究開啟一個嶄新的世代。這篇文章將會介紹三代定序如何應用在 16S rRNA 全長定序，為學術單位、醫院和生技公司內的微生物研究者，提供一個強而有力的菌種鑑定工具。

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目錄
1. 16S rRNA 簡介
2. 第三代定序平台 PacBio
3. 微生物定序資料分析
4. 誰適合 FL16S？
5. 圖爾思的優勢
6. 常見問題
7. 使用技術服務

什麼是 16S rRNA？V3-V4？V1-V9 全長定序？
      16S rRNA 全長約 1500 nt，是原核生物核糖體小次單元 (Small subunit, SSU) 的重要組成。研究發現，轉錄出 16S rRNA 的 DNA 序列有九個高度變異的區域，V1-V9，因其特異性被廣泛用於細菌分類和系統發育學 (Phylogenetics) 研究。
      由於定序讀長的限制，先前研究僅能藉由 V3-V4 等部分序列，將不同細菌區分至「屬」的層級。然而，隨著三代定序技術的純熟，已能輕鬆完成高品質的 V1-V9 全長定序 (Full-Length 16S rRNA gene sequencing, FL16S)，讓細菌分類從「屬」進化到「種」，甚至是菌株 (Strain) 的層級。

(圖片來源：EZBioCloud Help center. (2017, MAY. 15). 16S rRNA and 16S rRNA Gene.)

從屬到種大突破 → 
【全長16S rRNA定序-從屬進階到種的新高度】
16S V3V4 vs. 16S Full length vs. Metagenome →
【Metagenome小學堂】誰是微生物探查的最佳解？

微生物定序 – 第三代定序平台 PacBio 原理與應用   
      PacBio 透過 SMRT (Single Molecule, Real-Time) 技術，在奈米孔槽 (Zero-mode waveguide, ZMW) 中持續偵測單一 DNA polymerase 聚合過程中釋放出的螢光訊號，完成單分子即時測序。若結合環形 library 結構的 CCS (Circular Consensus Sequencing) 定序模式，經重複定序可產生約 25kb 的長片段 Hifi reads (High-fidelity reads)，並使其定序準確率 > 99.9% (即 Q30 標準)。
      因此，將三代定序應用於 16S rRNA 全長定序，可輕鬆定序全長序列 (約1.5kb) 和維持高的準確率，進而更精確的鑑定細菌種類。   (圖片來源：Metzker, M. L. (2010). Sequencing technologies—the next generation. Nature reviews genetics, 11(1), 31-46.)

PacBio 定序原理 → 
【魚與熊掌皆可兼得–Pacbio 定序原理淺談】
多功能的 Hifi reads → 
【我全都要!! PacBio HiFi reads 讓你好貪心也沒關係】

微生物定序資料怎麼分析？帶你領略各式分析工具！
      全長 16S rRNA 的定序流程中，DNA 萃取、樣品建庫與定序上機和蓋房子一樣，需要生物資訊分析做最後的屋內裝潢。序列資料去除引子 (Primer) 與執行 DADA2 去噪分析後，產生與 OTU (Operational taxonomic unit) 類似但更為準確的 ASV (Amplicon Sequence Variant)，它同樣可以被視為一個物種的序列群集。
      生資團隊分析序列資料、建立 ASVs Table 後，透過「圖爾思雲平台」，即能輕鬆、即時地繪製和修改圖表。常見的分析應用包括：Alpha Diversity (同樣本或同分組中多樣性)、Beta Diversity (不同樣本或組間比較) 和 Community Composition 等。  

圖爾思為何是最佳選擇？用數據說服你！
圖爾思目前已服務超過 1200 個 FL16S 案件，高品質的產出獲得口碑與客戶信賴，更以堅實的生資團隊和雲平台服務脫穎而出。

• 4 大專業分工團隊，滿足客製化需求
• 全自動核酸純化系統，提升代抽服務的 DNA 品質
• 設置 3 個檢測點確保高品質定序