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【單細胞定序新知分享】 Single Cell Fixed RNA Profiling Kit

單細胞定序技術雖然逐漸普及於不同的研究領域，但是對於細胞品質的高度要求，一定程度限制了樣品來源的類型以及上機時間地點，讓研究人員仍然有許多大膽的想法等待著被實踐，而甫於2022年推出的 Single Cell Fixed RNA Profiling Kit (已更名為Single Cell Gene Expression Flex) ，能固定細胞當下的狀態並保存，不再受到樣品製備後須立刻上機的時間限制。

Figure 1 不再受限於時間地點的單細胞RNA定序 (10x Genomics)

技術特點與上機流程

依照建議的實驗流程，利用Fixation buffer (主成份為 4% Formaldehyde) 固定解離後的細胞，鎖定RNA的表現狀態後，樣品能在4℃保存一週，或是在-20℃/ -80℃儲存一到三個月，可以保留脆弱或是動態變化較為快速的細胞類型，也提供挑選後續上機樣品的彈性，多個時間點或是採集地點的樣品也能集中處理，降低批次效應帶來的影響。

固定後的細胞在上機包裹前，會先與高靈敏度的探針套組反應，依照基因表現量的高低，每個基因配置一到三組的Probe，確保最大程度覆蓋目標的一萬八千多個人類基因，在探針套組上也帶有Barcode序列，最多可以混和16個樣品在一個反應上機，能夠提升樣品上機的細胞數並降低實驗成本。

Figure 3 Probe可以專一性辨認基因序列，成對的Probe由LHS/ RHS組成，
Probe barcode最高有16種組合，可以用來區分樣品。 (10x Genomics)

實測數據展示

為了驗證細胞固定及保存的效果，人類PBMC樣品經固定後立即捕獲建庫 (Day0)、於4℃保存一週或是-80℃保存一個月，可以觀察到各個主要的細胞類型組成比例皆穩定。

Figure 4 人類PBMC 樣品固定後，分別保存不同長度的時間後上機分析，驗證儲存細胞樣品的能力 (10x Genomics)

Fixed RNA Profiling內建區分樣品的Barcode序列，為了驗證區分樣品是否會造成批次效應影響分群結果，將人類PBMC樣品固定後分為16等份，每一份使用不同的barcode組合的Probe，最終再將樣品合併後上機，合併檢視可以觀察到不同的細胞類型，依據Barcode將全數樣品區分開來，各樣品間也呈現一致的細胞分群結果，沒有觀察到明顯的批次效應。

結論與技術比較

搭配預先固定細胞的實驗流程，Fixed RNA Profiling解決了以往單細胞樣品儲存、多批次樣品收集處理的問題，也讓以往無法達到樣品需求的脆弱細胞及珍貴樣品，有得以分析的可能，擴展技術應用的範圍，為單細胞RNA定序技術的未來創造更多的可能性。

我們也整理出目前Single Cell Gene Expression相關的應用技術，希望能幫助用戶挑選出最適合自己的服務品項。

	Single Cell Gene Expression	Single Cell Immune Profiling	Single Cell Gene Expression Flex
技術原理	poly-dT 3’ Gene expression	poly-dT 5’ Gene expression	Probe-based
技術特點	分析基因表現結合抗體標記提供更多資訊	分析TCR/BCR 序列並結合基因表現資訊	不受立即上機的時間限制可分析經過固定的細胞
延伸應用	Cell Surface Protein CRISPR Screening Sample multiplexing with 3’ CellPlex	Cell Surface Protein Antigen Specificity BCR/TCR Sequencing CRISPR Screening	Cell Surface Protein Built-in sample multiplexing
目標基因Panel	Human (pre-designed and custom) Mouse (custom)	Human (pre-designed and custom) Mouse (custom)	N/A
細胞通量	Standard: 10,000 cells per channel; up to 80,000 cells per chip; 140,000 cells per chip with 3’ CellPlex High: 20,000 cells per channel; up to 320,000 cells per chip; up to 730,000 cells per chip with 3’ Cellplex	Standard: 10,000 cells per channel; up to 80,000 cells per chip High: 20,000 cells per channel; up to 320,000 cells per chip	Singleplex: 10,000 cells per channel; up to 80,000 cells per chip Multiplex: 128,000 cells per channel; up to 1,024,000 cells per chip
樣品需求	Cells or nuclei	Cells	Fixed cells or nuclei
適用物種	可應用於多個物種	TCR/BCR僅限於人類及小鼠	目前僅提供人類基因的探針組合，小鼠即將推出
上機儀器	Standard: Chromium Controller, X/iX High: Chromium X	Standard: Chromium Controller, X/iX High: Chromium X	Chromium Controller X/iX only

Ref. :10x_SAM000578_Decision-Guide_Single_Cell_Gene_Expression

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2022．11．10