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2022．10
基因編輯專家-Synthego
Synthego以其工程學背景革新基因編輯工程技術與極限；垂直整合硬體、軟體、化學和分子生物學，利用機器學習、自動化和生物資訊來建立大規模的產品設計與生產平台：Halo與Eclipse；核心使命是為了提供快速、高通量、高效、價格負擔合理的CRISPR產品，使生命科學的基礎研究、目標驗證、至臨床試驗引入，變得靈活。
CRISPR-Cas9所組成的RNA-protein complexes (ribonucleoproteins,簡稱RNPs)1 (圖一) 賦予人們主宰基因的控制力；原本被細菌用來修復基因組的CRISPR-Cas9 RNPs 由可編程的引導RNA（gRNA）和Cas9核酸酶所組成，RNP complex與目標位點結合併切割。科學家們可以使用這種相對簡單的分子工具，對任何基因組進行幾乎任何編輯，然而當人們關注CRISPR的無盡應用，科學家在進行CRISPR實驗時面臨的日常問題卻很少得到同樣的關注。
(圖一)
(圖二)
(圖三)
參考文獻 Reference
1. Lino, C. A., Harper, J. C., et al. (2018). Delivering CRISPR: a review of the challenges and approaches. Drug Delivery, 25(1), 1234–1257.
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CRISPR-Cas9所組成的RNA-protein complexes (ribonucleoproteins,簡稱RNPs)1 (圖一) 賦予人們主宰基因的控制力；原本被細菌用來修復基因組的CRISPR-Cas9 RNPs 由可編程的引導RNA（gRNA）和Cas9核酸酶所組成，RNP complex與目標位點結合併切割。科學家們可以使用這種相對簡單的分子工具，對任何基因組進行幾乎任何編輯，然而當人們關注CRISPR的無盡應用，科學家在進行CRISPR實驗時面臨的日常問題卻很少得到同樣的關注。
(圖一)
gRNA和Cas9的格式是設計CRISPR實驗時首先需要考慮的重要因素，科學家多數選擇暫時表現來進行CRISPS編輯，而暫時表現可由質體轉染 (Plasmid and transfection)、或synthetic single guide RNA（sgRNA）和Cas9蛋白組成的RNPs來達成。質體轉染的方式很快地變得普及，因其成本低廉，而且可搭配螢光或抗藥性等挑選標記 (selection marker)。然而以結果來說，RNPs的優點多多：
1. 編輯效率
Snythego實驗室平行比較RNP與質體系統，在所有測試的濃度中，RNPs較質體皆得到更高的基因敲除效率(Indel frequency)（圖二）。且在5:1和9:1的比例下，AAVS1、EMX1、VEGFA在用RNPs的編輯效率都大於90%。質體的編輯效力則顯示低於50%，甚至在某些條件下無法檢測到編輯；如AAVS1和VEGFA來說，小於3.5 μg的質體幾乎無任何編輯效力
(圖二)
2.脫靶效應 (Off-target Effects)
CRISPR實驗最令人擔憂的因素之一：非特異性編輯，亦稱脫靶效應，這類非預期編輯可能改變表型 (phenotype) 、甚至對目標細胞、生物體有致命性的傷害。
質體由於在細胞內停留的時間較長，可能持續數週，造成大量的gRNA和Cas9被表達，增加了錯誤編輯的機會。研究顯示，RNPs CRISPR引發脫靶突變的頻率較低2, 3，Liang等人2針對OT3-18進行基因編輯，相較於質體系統，RNPs脫靶突變的機率低了28倍。這可
能是因RNP在細胞內的活動時間有限，RNPs作用快速，且在細胞內僅持續約一天就被降解3。
3.細胞存活率
DNA轉染往往對細胞有壓力，許多化學轉染法不利於細胞生存與活性，而細胞毒性甚至可能來自質體本身。Synthego的數據顯示，同樣使用nucleofection作轉染，質體用量與細胞活力成反比，意味著質粒濃度越高，細胞毒性越高；另低濃度的質體之編輯效率也相對較低；而RNPs不但細胞毒性明顯較低，同時提供高效率的編輯。(圖三)
CRISPR實驗最令人擔憂的因素之一：非特異性編輯，亦稱脫靶效應，這類非預期編輯可能改變表型 (phenotype) 、甚至對目標細胞、生物體有致命性的傷害。
質體由於在細胞內停留的時間較長，可能持續數週，造成大量的gRNA和Cas9被表達，增加了錯誤編輯的機會。研究顯示，RNPs CRISPR引發脫靶突變的頻率較低2, 3，Liang等人2針對OT3-18進行基因編輯，相較於質體系統，RNPs脫靶突變的機率低了28倍。這可
能是因RNP在細胞內的活動時間有限，RNPs作用快速，且在細胞內僅持續約一天就被降解3。
3.細胞存活率
DNA轉染往往對細胞有壓力，許多化學轉染法不利於細胞生存與活性，而細胞毒性甚至可能來自質體本身。Synthego的數據顯示，同樣使用nucleofection作轉染，質體用量與細胞活力成反比，意味著質粒濃度越高，細胞毒性越高；另低濃度的質體之編輯效率也相對較低；而RNPs不但細胞毒性明顯較低，同時提供高效率的編輯。(圖三)
(圖三)
此外，外來DNA可能會引發primary human cells 與 pluripotent cells的cyclic GMP-AMP synthase的激活。文顯顯示使用RNPs較適合用於胚胎幹細胞 (mbryonic stem cells)進行CRISPR基因編輯，可獲得至少2倍的存活細胞3。
4. 節省時間與人力
質體轉染CRISPR除了需自行製備材料，耗費人力。另如前述，RNPs的編輯效率經常超過70%，因此其實不需要質體上添加的挑選標記（如：抗生素基因）來富集CRISPR成功的細胞。
綜觀以上RNPs其實能讓研究人員更快、更節省經費地拿到成功基因編輯的模式細胞或動物，因此Synthego專注於的CRISPR RNPs之相關產品的精進，用其扎實的工程背景，投注於化學合成型sgRNA的設計、生產與製造。
相較於傳統以in vitro transcription (IVT) 生產的gRNA，透過化學合成 sgRNA，能夠精準掌握純度、序列正確性，這些都代表著更高效、穩定、精確的基因編輯結果，亦可讓使用之研究者自由、精準地根據細胞類型、編輯目的去調整sgRNA的用量。化學合成sgRNAs也可在特定的鹼基上進行化學修飾，以抵抗外切酶和免疫系統的降解，進一步提高編輯效率。想了解如何使用化學合成sgRNA與證明其強大效力的數據，可參考Synthego所準備的Tech Note
Synthego不斷地提升sgRNA的品質、同步降低成本與生產時間，提供各種應用等級的sgRNA客製產品，包含學術研究用等級的RUO、跨足臨床研究的GMP-like、以及可供臨床使用的GMP。其產品與技術可見於數以百計的文獻，亦被數以千計的商業、學術研究人員、以及治療性藥物開發商所使用，通過前所未有的規模提供CRISPR工具，以探索基因組功能、實現下一代藥物的誕生。
綜觀以上RNPs其實能讓研究人員更快、更節省經費地拿到成功基因編輯的模式細胞或動物，因此Synthego專注於的CRISPR RNPs之相關產品的精進，用其扎實的工程背景，投注於化學合成型sgRNA的設計、生產與製造。
相較於傳統以in vitro transcription (IVT) 生產的gRNA，透過化學合成 sgRNA，能夠精準掌握純度、序列正確性，這些都代表著更高效、穩定、精確的基因編輯結果，亦可讓使用之研究者自由、精準地根據細胞類型、編輯目的去調整sgRNA的用量。化學合成sgRNAs也可在特定的鹼基上進行化學修飾，以抵抗外切酶和免疫系統的降解，進一步提高編輯效率。想了解如何使用化學合成sgRNA與證明其強大效力的數據，可參考Synthego所準備的Tech Note
Synthego不斷地提升sgRNA的品質、同步降低成本與生產時間，提供各種應用等級的sgRNA客製產品，包含學術研究用等級的RUO、跨足臨床研究的GMP-like、以及可供臨床使用的GMP。其產品與技術可見於數以百計的文獻，亦被數以千計的商業、學術研究人員、以及治療性藥物開發商所使用，通過前所未有的規模提供CRISPR工具，以探索基因組功能、實現下一代藥物的誕生。
