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2020．06
單細胞定序分析介紹 (六): 細胞標記 SingleR介紹
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上一篇文章介紹了細胞標記可參考的資料庫，這邊小編要來詳細介紹SingleR[1] --- 自動化標記細胞的套件。SingleR內建參考資料數據，包含細胞對應的基因表現量表、每一顆細胞的 cell type 註解（一個 cell type 可能有多個重複）。注意，小編這裡介紹的是舊版本(v1.0.1)，新版本已整合至bioconductor，方法及說明可能略有不同，若對新版本感興趣請參閱對應內容：https://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/SingleR.html。
SingleR步驟
SingleR有兩種模式定義細胞類型：
- 對每一顆細胞個別分析，進行後面計算。
- 對每一個 cluster 分析，進行後面計算。每一個 cluster 的表現量為該 cluster 內所有細胞表現量的總和。預設10類，euclidean distance + ward method；亦可根據 Seurat 分群結果。
[step 1]：Spearman correlations
選用參考資料當中 variable genes 作為標的、計算跟測試資料的 Spearman correlation。
- Variable genes 定義：相比其他 cell types，在某 cell type 具有較高表現量（中位數）的前N個基因。
- Variable genes 數目（N）：有兩種模式 “de” & “sd” 可以定義，預設使用 “de”。 “de” 這個方法會使多 cell types 時用少量 genes、少 cell types 時用大量 genes，分布如下圖。
例如，參考資料 Immgen 總共有 253 個 cell types，N 一開始設定就是 20，到最後一步只剩一個 cell type 的時候，就會以 top 500 個 genes（N=500）計算參考資料跟測試資料的細胞相關性。
[step 2]：Aggregation of scores by cell types
參考資料當中相同 cell type 的細胞可能有重複，也因此與測試細胞會有多筆相關性分數，所以每一輪會挑出 80th 百分位的分數，使得最終測試細胞跟 cell type 只有一個相關性分數。
[step 3]：Fine-tuning
這一步主要是區分相似度較近的 cell types，例如下面第二張圖片可以看到 T regulatory cells 或 CD4+ T memory cell 對於這一顆測試細胞有接近的分數，究竟要判斷為哪類細胞？ SingleR Fine-tuning 的做法是把前一步結果做「逐步淘汰」，去掉分數最差的值、或是比最高分低超過 0.05 分的其他 cell type 去掉。接著剩下來的 cell type 又回到 step 1，重複直到收斂，最後剩下的 cell type 即是測試細胞的標記結果。下面的圖是某一顆細胞經過[step1 ~ step3]多次迭代的結果，最後這顆細胞就會被標記為 T regulatory cells (Treg)。
結語
SingleR 自帶參考資料，對於初步檢視未知樣本的 cell type 有很大的幫助；而這也延伸出值得注意的問題是，參考資料對於測試資料的「適用性」，舉個最暴力的例子就是：使用SingleR 的人類資料，但測試樣本來自老鼠，SingleR 一樣會算出結果，但這就是不合理標記。也因此，SingleR 並沒有硬性規定參考資料，使用者亦可已匯入自定義的 cell type 資料做 training。另外，SingleR 的方法只有「最佳解」，沒有「無解」，對於每一顆細胞都一定會標記一個細胞類別，沒有 unknown 這個類別。
總結來說，自動化細胞標記需要注意的是 (1) 參考資料－reference dataset (2) 分類模型－classifier。兩者是相輔相成的，如果樣本細胞組織來源跟參考資料的細胞組織來源相同，那麼標記結果的正確性會大大提高，然而分類模型若無法合理劃分不同細胞類型則功虧一簣。至於哪一個 cell type annotation 工具比較好，這裡有一篇比較性文章[2]，就給大家參考囉。
參考資料
參考資料
1. Aran, D., et al., Reference-based analysis of lung single-cell sequencing reveals a transitional profibrotic macrophage. Nature Immunology, 2019. 20(2): p. 163-172.
2. Abdelaal, T., et al., A comparison of automatic cell identification methods for single-cell RNA sequencing data. Genome Biology, 2019. 20(1): p. 194.
圖爾思生物科技 / 微生物體研究中心
謝馥媺 文案
