單細胞定序分析介紹 (二): Seurat
隨著定序技術以及微流體技術的發展，單細胞定序的技術也越來越純熟。實驗技術方面全力衝刺，當然在後端資料分析研究也不能落人後！今天小編要來跟大家介紹一個強大的單細胞分析R套件 – Seurat [1][2]。它有多厲害呢？嘿嘿，就讓我們繼續看下去。我們這次介紹的是它的基本功能(Guided tutorial Vignettes [3])。
每一顆微滴 (GEM，Gel Bead in Emulsion) 理論上要包裹一顆細胞跟一顆凝珠膠體 (下圖左邊 eppendorf 內，每顆有顏色的分子)，然而在過程中，有些微滴可能沒有包到細胞 (下圖黃色/淺綠色分子)、又或者同時包到兩顆細胞。前者如果又剛好包到破碎細胞的游離 RNA 分子，其表現量資料就只會含有少量的基因數目；反之，後者則會有異常高的基因數目。
此外，有些微滴雖然正確地包到一顆細胞，但是這顆細胞可能正在進行細胞凋亡(瀕死細胞)，所以會有高比例的粒線體基因。下圖中每個點代表每一顆細胞的資訊，這張圖能協助辨別上述狀況，並進一步將這些異常的細胞移除，以免影響後續資料分析。
(1) nFeature_RNA：每顆細胞的基因數目，大部分的細胞基因數為 800-1000 左右。
(2) nCount_RNA：每顆細胞的總 UMI count (Unique Molecular Identifier，一個RNA分子的標記；可以把它想成基因表現的量化標記)，大部分細胞為 2500 左右。
(3) percent.mt：粒線體基因占比 (粒線體基因總 UMI count ÷ 細胞的總 UMI count)，有幾顆細胞很離群，明顯高於其他細胞的粒線體基因數。
最後，Seurat範例是挑選基因數目(nFeature_RNA)介於 200-2500 之間、粒線體基因占比(percent.mt)小於 5% 的細胞做後續分析。
像這種 violin plot 若使用其他 R 畫圖套件(例如ggplot2)也可以畫，但是必須先算出 total UMI count、gene numbers。而使用 Seurat 的好處是，當我們將單細胞資料匯入 Seurat 變成 Seurat Object時，它會自動幫我們計算每顆細胞對應的total UMI count、gene numbers， 從 SeuratObject@meta.data 可以看到像這樣的資訊，省去很多繁瑣的步驟。
Normalization 標準化 過濾低品質細胞後，Seurat 接著會對每一顆細胞個別標準化(預設方法為log-normalize)，主要目的是調整細胞內基因 UMI count 的分布，但是細胞內每個基因 UMI count 相對比例不變。同時，假設我們的資料是來自兩個樣本庫(library)，因為除以細胞的 total UMI count，也會把定序深度的影響降低。
Scaling 特徵縮放 這個步驟是針對每一個基因的 UMI count 分布做校正，使得基因在所有細胞的UMI count平均為0，標準差為1 (哇哈哈，沒錯，就是 Z score轉換)。
下面這張圖可以很明顯地看到 UMI count 經過這兩個步驟的分布變化，由左至右分別為：原始 UMI count、標準化 UMI count、縮放後 UMI count。(註：此圖使用之資料與 Seurat 示範一樣是 2700 single cells, sequenced on the Illumina NextSeq 500，但 Seurat 官網沒有提供這張圖)
Feature Selection 特徵選取 Seurat 當中，這個步驟是想要挑選細胞當中高變異的基因(HVGs，highly variable genes)，目的是移除沒有資訊的基因、辨別比較相關的基因，以減少維度提高計算效率[4][5]。不過，這個步驟是否需要、使用 HVG 的限制[6]、該選用多少 HVGs (Seurat 目前預設2000)、或選用其他特徵挑選方法(例如 highly expressed genes, deviance, dropout distribution…等)做後續分析[7]，見仁見智，目前還沒有明確定論。
Dimensional Reduction 特徵選取
關於線性降維方法，小編猜想大家耳熟能詳的應該就是 PCA (Principle Component Analysis)吧！Seurat 只需簡單一個步驟就能將細胞分群的 PCA 結果完成，有沒有很厲害！另外，可能有人想進一步了解 PCA 主成分，這邊 Seurat 提供 ElbowPlot 及 JackStraw Plot 讓大家看主成分的 p-value 及解釋的變異度。不過值得注意的是，有時候單細胞表現量資料太過於複雜(不是線性關係的時候)，PCA 可能就無法完美地將細胞群分開，所以才有了 tSNE、UMAP 方法，而這些 Seurat 都能做到。(來來來～掌聲加尖叫)
Cluster Biomarkers 細胞群落標記
重頭戲來啦！當我們經過上述的分析流程後，這邊舉例兩種探討方向：
(1) 對某一群細胞特別感興趣，想找 DE genes (differentially expressed genes)，Seurat 可以列表將這些 DE genes 找出來。
(2) 對特定基因感興趣，想看在不同細胞群中的表現情況，呈現如下圖。
後記 Seurat 是一個非常強大的R分析套件(可謂包山包海)，不過在使用套件之前還是建議大家先了解計算原理、背景、參數設定，才不會繞了很大一圈做白工，得到錯誤的結論。當然，Seurat 不只有這些功能，比方說他們還有一個新的 normalization 方法[8]，就等大家慢慢探索囉！
參考文獻
[1] Butler, A., Hoffman, P., Smibert, P., Papalexi, E., & Satija, R. (2018). Integrating single-cell transcriptomic data across different conditions, technologies, and species. Nature Biotechnology, 36(5), 411–420.
[2] Stuart, T., Butler, A., Hoffman, P., Hafemeister, C., Papalexi, E., Mauck, W. M., III, et al. (2019). Comprehensive Integration of Single-Cell Data. Cell, 1–37.
[3] https://satijalab.org/seurat/v3.1/pbmc3k_tutorial.html
[4] Brennecke, P., Anders, S., Kim, J. K., Kołodziejczyk, A. A., Zhang, X., Proserpio, V., et al. (2013). Accounting for technical noise in single-cell RNA-seq experiments. Nature Methods, 10(11), 1093–1095.
[5] Luecken, M. D., & Theis, F. J. (2019). Current best practices in single‐cell RNA‐seq analysis: a tutorial. Molecular Systems Biology, 15(6), e8746–23.
[6] Yip, S. H., Sham, P. C., & Wang, J. (2018). Evaluation of tools for highly variable gene discovery from single-cell RNA-seq data. Briefings in Bioinformatics, 21(7), 1160–7.
[7] Townes, F. W., Hicks, S. C., Aryee, M. J., & Irizarry, R. A. (2019). Feature Selection and Dimension Reduction for Single Cell RNA-Seq based on a Multinomial Model, 17(1), 64–31. (Preprint)
[8] Hafemeister, C., & Satija, R. (2019). Normalization and variance stabilization of single-cell RNA-seq data using regularized negative binomial regression, 3(29), 861–17. (Preprint)
