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2020．01
2020 Asia Microbiome Conference 三大焦點：研究和產業趨勢、營養與益生菌、青年科學家交流
一、微生物體研究和產業的發展趨勢
以牙周病快篩檢測牙菌斑菌群
國防醫學院劉正哲副教授介紹了應用基因檢測技術，自行開發的牙周病（Periodontal disease）快篩檢測試紙
牙周病為一慢性需要長期治療的疾病，對於健保支出是一項經濟上的負擔，且近年研究發現牙周病菌會經由不同的途徑進入身體器官組織，造成各類疾病，例如在阿茲海默症患者的腦中可檢測出牙周病菌的 DNA，以及心血管疾病的病患血管中發現牙周病菌斑等。近年來由於定序和分子檢測技術越來越精準，牙菌斑菌群經定序分析後，發現有三種細菌為主要開始造成牙周病病程，其中又以 P. gingivalis 為主要致病菌。
傳統牙科以培養或分子檢測的方式檢測 P. gingivalis，缺點是費用高、需時長以及操作繁瑣等，因此劉老師研究團隊開發了一種成本低且快速檢測的方法，以側流免疫分析（lateral flow immunoassay）作為技術平台，使用奈米金接核酸作為探針來檢測目標菌 P. gingivalis，優點為取得牙菌斑後不需經培養，直接萃取核酸後檢測 16S rRNA，進行初步快篩檢測，之後依據結果在進入正式醫療程序，此技術目前經臨床試驗顯示具有相當高的專一性與靈敏度，未來將持續收集各式臨床牙周病病患樣本，持續優化技術。劉教授認為檢測技術的發展不應是單獨使用，目前臨床上一些檢測也是互相重複確認結果，若未來 NGS 的檢測成本更低，在臨床診斷上可與其他檢測方法一起搭配，朝向預防醫學的目標邁進，做到既精準又具預防的功能。
以次世代和三代定序來分析抗生素抗藥菌株
中正大學黃耀廷教授表示，他們以宏觀基因體定序分析抗生素抗藥菌株（combating antibiotic）的研究，並比較次世代定序（Short-read）與三代定序（Long-read）的差異性與優缺點。總體來說，次世代定序的優點是成本低，相關應用分析軟體支援多，且靈敏度較高，但也因此得到的片段較短且混亂，致使分析上較複雜，因而準確度較三代低。三代定序的優點為準確度高，靈敏度高，速度快，可得到較長完整的片段，可作為real time的診斷，缺點是成本高，支援分析的軟體較少。另外在實際臨床分析中也發現一些值得注意的現象，定序分析的結果雖然可以得知菌株種類，但無法得知是否具有抗藥性，因為細菌會以水平基因轉移（horizontal gene transfer）方式或是累積突變後演化成抗藥性，使得分析難度提高，具突變性的抗藥性細菌，只要有點突變發生就會造成高度抗藥性現象產生。
史丹佛大學的團隊的近期發表使用三代定序分析人類糞便樣本，發現了很多新菌種，其中有些是無法經由體外培養，經定序分析後可排列得到完整漂亮的基因體圖譜，甚至在不同時間點做定序，可看出整個基因體的動態變化，這跟黃教授在分析臨床病患用藥前後的定序結果類似，每個時間點的定序分析結果都不一樣，並可看到跳躍子（Transposon）跳來跳去的現象，證明細菌的演化是非常快的。此外，醫生給予病患不同抗生素會造成一定的突變發生，一些演化的理論指出，當一個菌具有抗藥性，是因為有很多突變必須同時存在，菌株才能存活下來。
黃教授並指出使用 NCBI 資料庫比對定序結果，得到的資料很雜亂，因此很多單位會自行整理資料庫（DATABASE），例如美國 FDA 就有自己的資料庫。另外使用統計和大數據深度學習的綜合數據工程演算法，也可提高抗藥性基因的分析。
以宏觀基因體次世代定序（mNGS）診斷感染
圖爾思生技郭育倫技術長分享關於宏觀基因體次世代定序（metagenomic NGS, mNGS) 於近幾年在臨床應用於檢測腦膜炎、敗血症、中樞神經感染與肺炎感染的案例，由於這幾個疾病在臨床上目前很難早期檢測出確切的感染病原體，通常都以廣效抗生素治療，未能針對病原體對症用藥，因此常出現病患被延誤治療，造成病情很快惡化。使用 mNGS 定序分析，能夠經由完整基因體分析，檢測出確切病原體及是否具有抗藥性，並可發現新病原體，及排除是否為感染性疾病，在臨床上能減少病患病程，以及不必要的醫療資源使用。例如在結核桿菌的臨床傳統檢測培養需4到6周，且失敗率高，陽性率低，操作繁瑣，而以 mNGS 定序技術檢測病原體總基因組，兩天內可知道結果，陽性率約30%-60%，且價格較細菌培養和 PCR 便宜。另一個全球首例是，病患反覆發燒，做了多種檢測都無法確認感染源，用廣效性及其他許多抗生素都無效，之後病患昏迷癲癇進入 ICU 後，使用 mNGS 檢測出是螺旋鉤蟲感染，改用正確用藥後32天就痊癒出院。
mNGS 應用在精準診斷感染醫療上為一新利器，未來若能持續的提升檢測速度和數據分析方法與準確率，將可應用在更多的臨床檢測項目。
全球微生物產業趨勢
近年來微生物體（Microbiome）相關技術在全球創投是熱門題目，Pacific 8 Ventures 傅斯誠合夥人/醫師分享了目前全球微生物體技術在產業發展趨勢。
在最新的產業發展方面，美國一家公司的產品只要以一管血液，就能檢測一千多種病菌，快速檢測病人感染的主因。另一家美國公司則是提供消費者可以上網訂購分析腸道微生物的產品，並根據檢測結果給予健康方面的建議。
因應微生物體產業的發展，許多相關的組織也應運而生，例如位於美國的糞便移植資料庫（FMT BANKs） 的非營利組織 OpenBiome，可提供轉殖與捐增的資料庫服務；有些公司甚至提供微生物改造工程的客製化服務，提供學術或產業單位改造特定的細菌或菌叢，可應用各種疾病的治療。舉例而言，透過改造益生菌，使其產生病患體內缺乏的酵素，讓菌落在腸道內持續產生酵素補給，來治療疾病。目前已有各種的 FMT 在臨床試驗，預計在未來幾年就會有微生物治療產品上市。此外，目前在免疫療法中發現，有些病患體內存在某些菌株，對免疫療法的反應較佳，因此許多大藥廠紛紛投入大量資金研究開發，以期能找到適當的菌株，提升免疫療法的成效。
由於發展快速，微生物體產業目前也面對許多的挑戰，例如：在數據分析上過度簡化問題、找到最接近人類的動物模式、許多作用的理論機制尚未完全清楚、專利策略問題、臨床試驗的設計、安全性考量、製造量產標準以及市場、投資人與消費者的適當觀念建立等等。雖然面臨許多挑戰，但從 2009 年來全球在微生物體產業的投資資金依然持續的快速暴增，微生物體產業在全球投資界目前無疑是相當地炙手可熱。
多吃多長高？ 營養共舞腸道益生菌之學童體位研究
台北醫學大學謝榮鴻教授長年投入學童健康體位研究與相關輔導推廣計畫，指出近年我國學童平均身高逐年下降歸因於均衡飲食的概念並未普及，他帶領團隊著手腸道菌與營養之於體位發展的研究。先前相關研究指出，在一般營養狀態下腸道中的胚芽乳酸桿菌（Lactobacillus Plantarum）會製造短鏈脂肪酸（short-chain fatty acid），誘發類胰島素生長因子（Insulin-like growth factor-1, IGF-1）而促進長骨生長。
研究團隊進一步以對照組的營養不良小鼠實驗，證實特定該菌種與其分泌的 IGF-1 對體位發展的高度關聯性。此外，抗生素亦引起研究團隊的重視，食物鏈中殘留的抗生素改變腸道菌相而促進小鼠體位發展和成熟，後期生長卻趨於遲緩且易於堆積脂肪；已有文獻指出，使用低劑量抗生素治療 （low-dose antibiotic treatment）於中低收入階級營養不良的青春期前兒童可刺激早期發育。
謝教授呼籲大眾應正視兒童營養問題，以紅孩兒症（Kwashiorker）對照健康雙胞胎的腸道菌實驗做總結，指出重新建立極度惡性營養不良的孩童之腸道菌相具極限，因此日常均衡營養是不可或缺的。
精神益生菌 PS128 顧神經情緒率先從腸道下手
早先於 2015 年《Nature》以「Mental Health: Thinking from the gut」的標題刊登精神益生菌 (psychobiotics) 相關研究，指出腸道菌對於情緒及精神疾病易扮演著重要的角色。「腸道如同人體第二個大腦」，以胚胎學的角度來看，胚胎細胞首先發育為腸與腦並以神經系統串接，是為腸-腦軸 (gut-brain axis) 概念。
陽明大學蔡英傑教授從事細菌相關研究多年，認為腸道菌株可能直接影響大腦，該團隊以小鼠模型證實益生菌 L. Plantarum（PS128）進入腸道後，可間接預防和改善大腦激素的分泌，例如調節前額葉皮質多巴胺（dopamine）濃度提升和可體醇（cortisol）濃度降低，有效改善小鼠的類憂鬱、類焦慮、類妥瑞及類巴金森症狀。PS128 是目前全球唯一經研究證實能夠調節腦中多巴胺濃度的益生菌菌株。
研究團隊進一步透過小鼠行為模式實驗發現，帕金森氏症小鼠透過 PS 128 治療後其運動遲緩（bradykinesia）與動作協調能力被顯著改善，此外，PS 128 亦能改變與肥胖相關的腸道厚壁菌（Firmicutes）/ 擬桿菌（Bacteroidetes）的菌相比例。精神益生菌仍待更多研究厚植基礎。
乳香薑黃柑橘打擊慢性發炎 天然物成分改善腸道菌相
癌症化學預防（cancer chemoprevention）即以天然或合成之化合物預防、抑制、延緩或逆轉癌症的形成與發展，是目前預防癌症與疾病形成的重要策略。台灣大學潘敏雄教授基於食品保健與疾病預防的角度，以細胞模式與動物模式評估乳香樹脂、薑黃、柑橘果皮、薑、藍莓、茶等飲食中天然物活性成分之抗發炎和癌症化學預防等生理活性與分子機制，希望藉由飲食天然物的科學證據，提供疾病預防的新途徑。
潘教授特別提到，柑橘果皮中多甲氧基類黃酮（Polymethoxyflavones, PMFs）成分能夠抑制 BaP/ DSS 誘發的自嗜作用，達到抗腫瘤新生的效果，在小鼠模型中，PMF-A 和 PMF-B 能夠調控 SREBP-1 和 Perilipin-1 蛋白質表現而降低脂肪細胞生長。
此外，天然物成分可能改變腸道菌相，例如，山竹粹取物 Garcinol 可改善 HFD 誘發 (High Fat Diet-Induced) 的腸道菌叢不良 (dysbiosis) 同時增加丁酸鹽產生菌（Butyrate-producing bacteria, BPB）——隸屬於厚壁菌門 (Firmicutes) 的瘤胃球菌 (ruminococcaceae) 和毛螺菌 (Lachnospiraceae) 製造短鏈脂肪酸丁酸鹽 (butyrate)，丁酸鹽在調控基因表現上扮演了重要的角色，具有抗發炎跟調節免疫的功能。
膠囊包埋技術幫助益生菌通過胃酸到腸上皮細胞
葡萄王生技陳勁初總經理表示，發酵菌的培養、回收、乾燥等一系列加工流程看似簡易，其研究團隊針對不同的機型設計適合的加熱原理優化產率是關鍵。
另外，他們也進行研發膠囊包埋技術（Encapsulation）幫助益生菌，如 L. Acidphilus La-14、L. Plantarum GK4、Lc. Lactis、L. Plantarum GKM3、L.Brevis KB290 順利通過胃酸和膽鹽環境到達腸上皮細胞，致力於開發抗過敏、抗胃幽門桿菌、降低體脂肪、抗老化、提升記憶力等菌株。
三、青年科學家研究交流
即時直接分析（DART）一分鐘內搞定微生物次級代謝體分析
台灣大學徐丞志助理教授提到，腸道菌對膳食纖維發酵會產生次級代謝體，包括短鏈脂肪酸（short-chain fatty acids, SCFAs），如乙酸、丙酸、丁酸。許多研究指出， SCFAs 會對於人體造成各種不同的影響，與免疫調節、神經調節相關，於是分析短鏈脂肪酸是研究腸道菌相當重要的一環。傳統上，以層析分離搭配質譜的方法儘管具高靈敏性，往往需耗費過高時間和人力成本，有失為高效率的分析方法。
該研究團隊以即時直接分析（Direct Analysis in Real Time, DART）方法作為分析微生物次級代謝體的工具，其在常溫常壓下，載氣經放電產生等離子體，而其中的激發態原子瞬間脫附並離子化樣品中的化合物，進而以質譜或串聯質譜檢測，相關應用可見於美國團隊研發的「質譜筆 (MasSpec Pen) 」於癌症檢測，該技術提供了16 sRNA 基因測序以外的分析途徑，其高效率顯著見於分析時間從原來 10 分鐘大幅降低為 0.5 分鐘，能廣泛應用於大鼠糞便研究、微生物基因改造萃取液，期望未來陸續推廣至各實驗室並運用在臨床定量分析。
Dusp6 缺乏促棕色脂肪基因表現 提升燃燒脂肪和產熱
根據流行病學統計，已有許多科學證據指出肥胖和腸道菌群之間具關聯性，甚至進而透過改變腸道菌落達到控制肥胖的目的，儘管如此，多數文獻將焦點放在益生菌對代謝適應症的作用，而有關抗肥胖本身的資訊相當有限。成功大學阮振維助理教授透過標準化 Dusp6 基因缺失的小鼠模型 ，發現其對飲食誘發的肥胖具抗性，儘管該小鼠是健康個體，然而這在演化上是不合理的。
當我們進一步將鎂光燈打在宿主身上，是否演化機制留下的特定菌種能夠合理化這個現象？例如，冬眠前後或營養成分改變的狀況下，熊的腸道菌都會隨著環境被改變，這給了研究團隊一個新的點子，或許 Dusp6 會迎合寒冷菌相，後續研究發現，Dusp 6 缺乏會促進棕色脂肪基因表現，提升燃燒脂肪和產熱，RNA 定序亦證實這個想法，並有證據指出 Dusp 6 是微生物依存的產熱開關，且對新生兒腸道菌相的發展扮演至關角色。該研究盼透過腸道菌群益生菌或糞便微生物群移植開發新的抗肥胖策略。
宏觀基因體從零拼湊基因圖譜 微生物研究化繁為簡
對於我們所「已知」的細菌基因體，真的全數排除偏差值（bias） 解密了嗎？分析微生物體基因資料的難度主要來自於各種細菌基因序列的混雜。在面對數千個疾病相關的細菌宏觀基因組時，該如何在沒有參考資料庫的情況下重建基因體資料、甚至計算每個基因體的覆蓋性（coverage)）和豐富度（abundance）呢？
台北醫學大學吳育瑋助理教授指出，這樣的挑戰就像要破解幾百盒完全不同的拼圖在全部拆解後重新拼湊出來的複雜度一般。為了解決這個問題，該研究團隊開發出了分群演算法「MaxBin」，運用機率分析與機器學習演算法將微生物體基因序列進行分類，以簡化後續的各種分析與處理，簡而言之，從重新（de novo） 組裝（assembling）和分箱（binning） 即是宏觀基因體組裝基因體（ Metagenome-Assembled Genomes, MAG）演算模組二大精要環節。以拼圖作比喻，就是將幾百盒混在一起的拼圖分類為幾百堆，每堆只包含來自一種拼圖的碎片，大幅降低後續的分析複雜度，並藉由分群後的個別基因體促成我們對未知物種的認知。
吳助理教授進一步分享有趣的實驗，一隻相同細菌，利用「已知」細菌基因體比對 MAG 重建的基因體圖譜，發現一致性有所差距，約 70-80% 的基因是相近的、20-30% 則不一致，這樣的實驗結果顯示，我們對於「已知」的細菌基因體仍存有許多未知。最後，講者玩味地點出面對資料分析時，沒有一項工具能給完美的答案，盡可能排除黑盒子效應是我們當前能努力的方向。
以多體學分析共軛多炔次級代謝物
中研院農生中心楊玉良助研究員提到，共軛多炔（conjugated polyynes）是不穩定的次級代謝物，主要存在某些植物、海洋生物、和真菌體內找到。然而，僅有少數被發現存在於細菌，透過基因體分析技術。
他們的究團隊透過細菌多炔 BCGs 譜系分析， 發現只有 0.2% 的細菌種類，如 Massilia sp. YMA4 具有製造共軛多炔的潛力。由於共軛多炔的產量不穩定，該團隊透過綜合的多體學（Omics）的方法，包含 RNA 定序轉錄體及代謝體學等領域，在 Massilia sp. YMA4 和 Candida 培養基探討相關基因不活化與抗生素間的關聯性。相關研究盼提高生物防治劑和治療劑的效率，將原位代謝組學（如成像質譜）、比較代謝組學 （如分子網絡）和基因組/轉錄組技術整合為微生物天然產物研究的綜合策略。
楊助研究員最後指出，微生物固然重要，然而縱觀自然界，微生物僅是偌大問題裡面其中一個環節，具備多元的角度和廣闊視野解決問題，並多方嘗試與他人合作的能力更是重要。此外，更盼望國內學術界能凝聚力量，發展開放式平台助資源有限的研究環境創造更高的價值和可能性。
亞洲微生物體趨勢論壇提供台灣微生物學界和產業界一個討論交流的平台，讓台灣與亞洲的專家學者們齊聚一堂。綜觀本次論壇眾多研究，腸道微生物相和其他微生物與寄主健康和疾病之間的關聯性以及益生菌的開發已逐漸成為主流科學前沿。除了原本次世代定序和三代定序及宏觀基因體學應用於微生物研究之外，多體學研究特別是培養體和代謝體學以及無菌鼠的角色也越來越重要。最後，台大醫院吳明賢副院長提到，希望學界和業界積極參與及合作，促進微生物相的了解和加速實際的臨床應用，推動台灣精準醫療和健康進展。
▍文章轉發：基因線上
