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2018．11
16S/Metagenomics & Metabolomics 多體學新思維
原創文章 引用請註明出處
16S和Metagenomics能夠幫助科學家了解樣品內微生物的組成，甚至藉由metagenomics能夠解析基因功能，進一步了解微生物是如何影響宿主。單一體學的結果只能在因果關係中知道”果”的部分，缺少其他證據來證實這樣的果是如何造成的，因此近幾年來，多個體學的結合應用備受關注。圖一是目前多體學的研究思維，主要以腸道菌與宿主為例，分享三篇文獻供大家參考。
圖一、多體學架構思維
案例一、在肥胖與縮胃手術患者間之腸道微生物與血清代謝物的改變，找到可作為減肥的益生菌-BT菌
本篇探討肥胖與纖瘦者之間腸胃道菌相與代謝物間的差異，並檢視肥胖者在透過縮胃手術減重後，其腸道菌相與代謝產物是否有改變，與纖瘦者間是否有差異。先前研究已知腸道微生物與肥胖有關聯，作者結合Metagenomicsc和Metabolomics的數據進行關聯分析(圖二)，找到與纖瘦相關的菌種- Bacteroides thetaiomicron (BT菌)，該菌和血清中glutamate的濃度有關，且先前研究指出血清中高濃度的glutamate與肥胖有關，相關機制還有待驗證。
圖二、關聯分析，分析差異菌種與差異代謝物的關係。
依據基因功能預測的結果發現glutamate decarboxylase的基因表現量在肥胖者內較低，為了解微生物是如何影響宿主血清內glutamate的含量，進一步尋找有關的代謝路徑，最終發現BT菌會利用glutamate decarboxylase將glutamate代謝為GABA，降低血清中glutamate濃度 (圖三)。
圖三、代謝路徑圖與差異基因表現量。
最終依上述的結果進行實驗動物驗證，餵食小鼠高脂飲食和活/死 BT菌，觀察體中的變化，可見餵食活BT菌的小鼠體重沒有明顯變化 (圖四)。作者也進一步做臨床驗證，觀察縮胃手術患者在經過3個月的手術後BT菌與glutamate的變化。結果顯示，所謂手術者在3個月後體重降低，且其腸道BT菌的含量有增加，血清內glutamate的濃度有下降的狀況 (圖五)。
圖四、餵食小鼠高脂飲食並分成三組灌食PBS, KBT (失活BT菌)和LBT (具活性BT菌)，觀察體重變化。
圖五、左圖為BT菌在肥胖者與接受縮胃手術0到3月患者的含量，右圖為代謝物在接受縮胃手術0個月和3個月的含量變化。
結論: 作者利用metagenomics和代謝體學的方式找到可能影響肥胖的相關腸道菌種B. thetaiomicron，且該菌具有glutamate decarboxylase功能能降解血清中glutamate成GABA。依據本篇結果，BT菌未來有潛力發展成減肥益生菌。
案例二、腸道微生物藉由膽酸調控Natural Killer T (NKT)細胞來控制肝臟腫瘤大小
本篇著重於探討抑制肝臟腫瘤的原因與機制，越多的研究指出腸道微生物與antitumor immunity有關係。首先作者發現使用抗生素處理的腫瘤小鼠，其肝臟腫瘤大小相較於未處理組別較小。且發現在抗生素處理的組別中CXCR6+natural killer T (NKT) 細胞在肝臟的數量增加 (文獻中Fig1和Fig2)，並發現肝血竇內皮細胞(liver sinusoidal endothelial cells, LSEC)會分泌CXCL16來吸引NKT細胞駐留。 已知腸道菌參與膽酸的生合成路徑，為瞭解NKT細胞的活化是否與膽酸有關，作者用cholestyramine (CHOL)抑制肝腸循環，降低次級膽酸的含量，結果顯示NKT細胞明顯被活化。作者更進一步用標靶分析確認膽酸的含量，在抗生素處理後初級膽酸含量相較於控制組增加，而次級膽酸含量減少 (圖六)。
圖六、左圖使用cholestyramine抑制肝腸循環，降低次級膽酸含量，並計算活化的NKT細胞數量。右圖為測量初/次級膽酸在肝臟組織中的含量。
圖二、關聯分析，分析差異菌種與差異代謝物的關係。
依據基因功能預測的結果發現glutamate decarboxylase的基因表現量在肥胖者內較低，為了解微生物是如何影響宿主血清內glutamate的含量，進一步尋找有關的代謝路徑，最終發現BT菌會利用glutamate decarboxylase將glutamate代謝為GABA，降低血清中glutamate濃度 (圖三)。
圖三、代謝路徑圖與差異基因表現量。
最終依上述的結果進行實驗動物驗證，餵食小鼠高脂飲食和活/死 BT菌，觀察體中的變化，可見餵食活BT菌的小鼠體重沒有明顯變化 (圖四)。作者也進一步做臨床驗證，觀察縮胃手術患者在經過3個月的手術後BT菌與glutamate的變化。結果顯示，所謂手術者在3個月後體重降低，且其腸道BT菌的含量有增加，血清內glutamate的濃度有下降的狀況 (圖五)。
圖四、餵食小鼠高脂飲食並分成三組灌食PBS, KBT (失活BT菌)和LBT (具活性BT菌)，觀察體重變化。
圖五、左圖為BT菌在肥胖者與接受縮胃手術0到3月患者的含量，右圖為代謝物在接受縮胃手術0個月和3個月的含量變化。
結論: 作者利用metagenomics和代謝體學的方式找到可能影響肥胖的相關腸道菌種B. thetaiomicron，且該菌具有glutamate decarboxylase功能能降解血清中glutamate成GABA。依據本篇結果，BT菌未來有潛力發展成減肥益生菌。
案例二、腸道微生物藉由膽酸調控Natural Killer T (NKT)細胞來控制肝臟腫瘤大小
本篇著重於探討抑制肝臟腫瘤的原因與機制，越多的研究指出腸道微生物與antitumor immunity有關係。首先作者發現使用抗生素處理的腫瘤小鼠，其肝臟腫瘤大小相較於未處理組別較小。且發現在抗生素處理的組別中CXCR6+natural killer T (NKT) 細胞在肝臟的數量增加 (文獻中Fig1和Fig2)，並發現肝血竇內皮細胞(liver sinusoidal endothelial cells, LSEC)會分泌CXCL16來吸引NKT細胞駐留。 已知腸道菌參與膽酸的生合成路徑，為瞭解NKT細胞的活化是否與膽酸有關，作者用cholestyramine (CHOL)抑制肝腸循環，降低次級膽酸的含量，結果顯示NKT細胞明顯被活化。作者更進一步用標靶分析確認膽酸的含量，在抗生素處理後初級膽酸含量相較於控制組增加，而次級膽酸含量減少 (圖六)。
圖六、左圖使用cholestyramine抑制肝腸循環，降低次級膽酸含量，並計算活化的NKT細胞數量。右圖為測量初/次級膽酸在肝臟組織中的含量。
作者更進一步尋找與膽酸生成相關的腸道菌屬，進行16S分析，發現腫瘤鼠在經過抗生素處理後Clostridium spp.菌數量顯著減少，後續選擇人鼠共通的菌種C. scindens來進行驗證，先用抗生素處理後植入C. scindens, 結果發現腫瘤大小在植入該菌後回復到與和對照組(無抗生素處理)腫瘤大小無差異 (圖七)。
圖七、利用16S尋找抗生素處理前後的差異菌種-Clostridium spp. (Fig. D)。抗生素處理腫瘤鼠後，移植人鼠共有的菌種C. scindens進行實驗，觀察腫瘤大小的變化 (Fig. F & G)。
結論: 初期發現肝臟腫瘤大小與腸道菌有關，並發現關鍵抑制腫瘤大小的免疫細胞CXCR6+ NKT cells，該細胞數量會受到代謝物的影響，且已知腸道菌與肝臟相關的代謝物為膽酸，運用標靶代謝測量初/次級膽酸的含量，發現次級膽酸的含量在抗生素處理組較少。為驗證其與腸道菌相關，最終找到C. scindens與腫瘤大小有關，並在動物實驗中得到驗證。
案例三、利用代謝體與16S定序技術來研究高脂肪飲食對於認知退化(阿茲海默症前兆)的影響
文獻指出，認知退化與肥胖、腸道功能失調或腸道微生物生態失調之間有相關性。為了尋找相關的biomarker，本篇比較認知退化鼠(3xtg mice)在正常飲食和高脂肪飲食其腸胃道菌群和血清代謝物的變化。 實驗組別分成正常飲食組(ND)、高脂飲食組(HFD)、3xtg鼠正常飲食(3xtg)和3xtg鼠高脂飲食(3xtg-HFD)，利用非標靶代謝體學技術檢測血清或糞便內的差異代謝物(圖八)。
圖八、各組血清中的差異代謝物。 利用16S定序技術了解腸道中有哪些微生物(圖九)，並利用結合兩個體學的結果進行關聯分析(圖十)，尋找差異菌種與差異代謝物的關係。
圖九、16S解析糞便樣品的微生物組成，找尋有差異的菌種，以及比較各組是否有相同的菌屬。
圖十、正常飲食組與3xtg組差異菌種與差異代謝物之關聯分析結果。
結論: 3xtg鼠高飲食組別造成不飽和脂肪酸和膽酸的不足，以及產生過多的酮體、乳酸、氨基酸、TMA和TMAO。這些代謝物變化又與Enterococcaceae, Staphylococcus, Roseburia, Coprobacillus 和 Dorea等菌種有相關。未來可應用這樣的關聯分析來判別認知衰退的徵兆與尋找治療的方法。
總結，多體學的研究可幫助科學家從單觀察樣品菌種的變化到結合代謝體學的結果，更了解微生物和宿主間是如何交互作用，更能夠利用已知與微生物相關的代謝物，例如：膽酸或短鏈脂肪酸，藉由測量這些代謝物在檢體內的含量，來驗證菌群的變化。
參考文獻：
[1] Liu, Ruixin, et al. "Gut microbiome and serum metabolome alterations in obesity and after weight-loss intervention." Nature medicine 23.7 (2017): 859.
[2] Ma, Chi, et al. "Gut microbiome–mediated bile acid metabolism regulates liver cancer via NKT cells." Science 360.6391 (2018): eaan5931.
[3] Sanguinetti, Elena, et al. "Microbiome-metabolome signatures in mice genetically prone to develop dementia, fed a normal or fatty diet." Scientific reports 8.1 (2018): 4907.
圖七、利用16S尋找抗生素處理前後的差異菌種-Clostridium spp. (Fig. D)。抗生素處理腫瘤鼠後，移植人鼠共有的菌種C. scindens進行實驗，觀察腫瘤大小的變化 (Fig. F & G)。
結論: 初期發現肝臟腫瘤大小與腸道菌有關，並發現關鍵抑制腫瘤大小的免疫細胞CXCR6+ NKT cells，該細胞數量會受到代謝物的影響，且已知腸道菌與肝臟相關的代謝物為膽酸，運用標靶代謝測量初/次級膽酸的含量，發現次級膽酸的含量在抗生素處理組較少。為驗證其與腸道菌相關，最終找到C. scindens與腫瘤大小有關，並在動物實驗中得到驗證。
案例三、利用代謝體與16S定序技術來研究高脂肪飲食對於認知退化(阿茲海默症前兆)的影響
文獻指出，認知退化與肥胖、腸道功能失調或腸道微生物生態失調之間有相關性。為了尋找相關的biomarker，本篇比較認知退化鼠(3xtg mice)在正常飲食和高脂肪飲食其腸胃道菌群和血清代謝物的變化。 實驗組別分成正常飲食組(ND)、高脂飲食組(HFD)、3xtg鼠正常飲食(3xtg)和3xtg鼠高脂飲食(3xtg-HFD)，利用非標靶代謝體學技術檢測血清或糞便內的差異代謝物(圖八)。
圖八、各組血清中的差異代謝物。 利用16S定序技術了解腸道中有哪些微生物(圖九)，並利用結合兩個體學的結果進行關聯分析(圖十)，尋找差異菌種與差異代謝物的關係。
圖九、16S解析糞便樣品的微生物組成，找尋有差異的菌種，以及比較各組是否有相同的菌屬。
圖十、正常飲食組與3xtg組差異菌種與差異代謝物之關聯分析結果。
結論: 3xtg鼠高飲食組別造成不飽和脂肪酸和膽酸的不足，以及產生過多的酮體、乳酸、氨基酸、TMA和TMAO。這些代謝物變化又與Enterococcaceae, Staphylococcus, Roseburia, Coprobacillus 和 Dorea等菌種有相關。未來可應用這樣的關聯分析來判別認知衰退的徵兆與尋找治療的方法。
總結，多體學的研究可幫助科學家從單觀察樣品菌種的變化到結合代謝體學的結果，更了解微生物和宿主間是如何交互作用，更能夠利用已知與微生物相關的代謝物，例如：膽酸或短鏈脂肪酸，藉由測量這些代謝物在檢體內的含量，來驗證菌群的變化。
參考文獻：
[1] Liu, Ruixin, et al. "Gut microbiome and serum metabolome alterations in obesity and after weight-loss intervention." Nature medicine 23.7 (2017): 859.
[2] Ma, Chi, et al. "Gut microbiome–mediated bile acid metabolism regulates liver cancer via NKT cells." Science 360.6391 (2018): eaan5931.
[3] Sanguinetti, Elena, et al. "Microbiome-metabolome signatures in mice genetically prone to develop dementia, fed a normal or fatty diet." Scientific reports 8.1 (2018): 4907.
圖爾思生物科技 / 微生物體研究中心
沈筱凌 文案
