11
2021．08
基因的諾亞方舟:《脊椎動物基因體計劃(VGP)》
2007年5月31日，綠色和平組織在《聖經》中記載「諾亞方舟」停靠的亞拉臘山上，打造了一座諾亞方舟模型，呼籲世人若不愛惜大自然，將導致洪水、乾旱等天災的反撲。
我們的星球正在經歷第六次大規模滅絕事件，這是自6,600萬年前恐龍滅絕以來最嚴重的一次。絕大部分是由於人類對污染、棲息地的破壞和氣候變化的影響。在此刻，地球上有八分之一的脊椎動物物種（總共約8,000種）瀕臨滅絕的風險。而基因的諾亞方舟計畫: 脊椎動物基因體計劃（The Vertebrate Genomes Project, VGP）也因此因應而生。
VGP是由12個國家/50多個機構/數百名國際科學家所組成的Genome 10K (G10K) 的聯盟組織宣布的一項長期項目，估計總成本為6億美元，最初G10K計劃對至少10,000種脊椎動物物種的基因體進行定序，由G10K聯盟的命名也可以窺見一二，但隨著定序技術的進步以及成本降低，G10K決定增加定序物種至71,657種現存脊椎動物物種，且同時包含每個物種的雄性和雌性個體。VGP 將根據生物分類法的結構逐步完成，從最大的分類: 域(domain)到最小的分類: 物種(species)，將分為四個階段完成。目（第 1 階段）、科（第 2 階段）、屬（階段 3）最後是所有物種（階段 4）。而每一個階段物種的選擇都基於以下標準:
(1) 需要改進的現有基因體草圖的物種。
(2) 幫助了解人類生物學特殊特徵的物種。
(3) 瀕臨滅絕的物種。
(4) 在生物醫學研究有突出研究的物種。
VGP旨在建立近乎無錯誤的參考基因體組裝，這些基因體將用於解決生物學和疾病中的基本問題，識別遺傳風險最高的物種，並防止或至少最大限度地減少人類對環境影響造成的物種損失，保存生命的遺傳信息。
(附圖)技術新知_2
VGP提供的階段示意圖
VGP指出拯救物種和進行高品質基因體研究的一個主要挑戰是，大多數當前的基因體組裝都存在數十萬到數百萬個錯誤，其中未解析的複雜重複序列和單倍型異質性是組裝錯誤的主要來源。常見錯誤如部分基因缺失、部分基因體組裝錯誤、甚至有些基因則完全在組裝過程中丟失。由於先前都僅使用碎片化、容易出錯的組裝方法，在某些基因結構過於復雜的情況下，研究人員甚至不知道他們正在處理不正確的基因序列和結構，從而影響了許多科學發現和科學進步。因此，高品質無錯誤的基因體組裝和註釋是必要的。為了完成高品質的基因體組裝，VGP團隊強調“長讀長組裝”而不是“短讀長操作”。代表長讀長定序技術能最大化提高基因體品質，相較短讀長技術能更容易地將DNA序列組裝成整個染色體，數據的處理也由包含數百萬個碎片的拼圖，減少到數千個拼圖的拼圖等級。
(附圖)技術新知_3
左圖是第一代和第二代基因體定序方法的代表；以較小的拼圖表示短讀長片段，孔洞表示缺失信息。
右圖是用於 VGP 的第三代技術的代表，大塊拼圖塊代表長讀長片段。
在技術方面，VGP與行業合作夥伴合作開發了前所未有的高分辨率基因體定序方法，以低成本改進高分辨率基因體定序工作流程和計算管道。
合作夥伴包含:
(1) 定序和組裝公司: Illumina、Pacific Biosciences、Oxford Nanopore、Bionano Genomics、10X Genomics、NRGene、Dovetail Genomics、Phase Genomics、Arima Genomics
(2) 定序中心: 華大基因(BGI)、博德研究所(Broad Institute)、桑格研究所(Sanger Institute)、華盛頓大學基因體中心(Washington University Genome Center)）
(3) 公共基因體檔案和註釋中心: NCBI、Ensembl、UCSC
(4) 學術界和政府部門專家: NIH、NSF
在組裝品質評估方面，G10K提出了一套標準: 縮寫為x.y.P.Q.C
x = log10[contig NG50]
y = log10[scaffold NG50]
P = log10[haplotype phase block NG50]
Q = QV base accuracy
C = percentage of the assembly assigned to chromosomes
VGP設置的最低基因體品質指標為：
(1) contig N50 為 100 萬 bp (1Mb)
(2) scaffold N50為10Mb
(3) 由2個獨立來源確認90%的基因體組裝成染色體
(4) 鹼基QV值不低於 QV40（相當於10,000 bp 中不超過1個核苷酸錯誤）
(5) 單倍型定相。
稱之為3.4.2.QV40 PHASED METRIC。
2021年的4月28日， VGP迎來了第一階段的重大成果，發表在nature雜誌並獲選為當期封面，論文名稱為: 《Towards complete and error-free genome assemblies of all vertebrate species》，研究結果涵蓋了6個主要脊椎動物種系中的16個物種的基因體組裝結果。 (懶人包傳送門)
(附圖)技術新知_4
大多數基因體數據是在投資VGP的三個定序中心生成的，包括紐約洛克菲勒大學脊椎動物基因體實驗室(VGL)，英國Wellcome Sanger研究所和德國馬克斯普朗克研究所(MPI)。 VGP 基因體數據將在Genome Ark上公開提供。Genome Ark (https://vgp.github.io)是一個由亞馬遜雲託管的資料庫(s3://genomeark)，並在國際公共基因體瀏覽和分析資料庫（NCBI、ENSEMBL和UCSC）中進行註釋和顯示。VGP的組裝在DNAnexus上執行，且可供任何人使用。完整的原始碼可在github 上公開獲得（https://github.com/VGP/vgp-assembly）提供在本地端或DNAnexus平台上運行。
在第一階段，VGP結合了PacBio等長讀長技術和改進的演算法來生成初始Contig組裝，再使用遠程支架方法，將Contig放入染色體中，包括 10X Genomics linked-reads、HiC linked-reads和 Bionano 光學圖。Pipeline如下:
第 1 階段Pipeline
VGP 的下一步預計將生成260個物種的幾乎無差錯的參考基因體，這些物種代表所有脊椎動物的目，它們的分歧時間為約 5,000 萬年前 (MYA) 或更早，VGP將對異染色體（如果存在）進行定序，以便可以為每個物種組裝兩種性染色體。
VGP第 1 階段涵蓋物種
VGP目前大約每週組裝三個基因體，但需要擴大到每週組裝125個基因體才能完成所有約70,000個物種。VGP正在利用過去幾年定序技術的巨大進步，開始為所有7 萬種活的脊椎動物生產高品質的參考基因體。到目前為止，VGP已經完成了129個二倍體組合，代表了迄今為止這些物種最完整和準確的版本，而在不久的將來，將產生數千個基因體組合。就讓我們一起來期待這個天上飛的~路上爬的~海裡游的~通通不放過的基因級諾亞方舟-《脊椎動物基因體計劃(VGP)》!
參考資料
1. The Vertebrate Genomes Project官網 (https://vertebrategenomesproject.org/)
2. nature官網(https://www.nature.com/immersive/d42859-021-00001-6/index.html)
3. Rhie, A., McCarthy, S.A., Fedrigo, O. et al. Towards complete and error-free genome assemblies of all vertebrate species. Nature 592, 737–746 (2021). (https://doi.org/10.1038/s41586-021-03451-0)
4. 圖爾思第三代定序技術服務及研究中心 (Biotools TGSRC) Biotools TGS Research Center) (https://www.facebook.com/groups/883166995753861)
5. 諾亞方舟的故事│看雜誌 (https://www.watchinese.com/gb/node/4019)
圖爾思生物科技 / 微生物體研究中心
吳雁韻 文案
http://www.toolsbiotech.com/
© BIOTOOLS. All Rights Reserved
