細胞凋亡(Apoptosis)的幾種檢測方式
細胞凋亡(Apoptosis)偵測技術
細胞凋亡(Apoptosis)早期也被稱為Program cell death (PCD)，從字面上就可以理解細胞經過一連串固定的程序走向死亡的過程，在生物上如胚胎發育及維持正常機能扮演重要角色；例如人類手指在胚胎期是蹼狀，經過細胞凋亡過程將蹼間細胞組織消失，另外細胞遭到病毒感染啟動防禦機制也會採取細胞凋亡將自身細胞犧牲而不讓病毒增殖。
細胞啟動凋亡程序後，從不同階段可以觀察到細胞型態上的變化，如初期的細胞皺縮、細胞核仁消失等，粒線體釋出cytochrome C接連啟動後續Caspase家族蛋白的訊號傳遞；中期染色體斷裂，細胞體型走向”泡泡化”稱為凋亡小體(apoptotic body)，此階段到後期細胞漸漸裂解成多個泡泡體，每個泡體包含了包含了胞器還有裂解的染色體；凋亡後期這些凋亡小體逐漸被周邊組織吸收或被巨噬細胞吞噬。
初步瞭解了細胞凋亡的階段，就可以針對每個階段的特性進行形態上的觀察或是分子層次的偵測。以下分階段介紹現有常見的偵測技術：
初期偵測
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Annexin-V染色法
Annexin-V是一種分子量為35~36KD的Ca2+依賴性磷脂結合蛋白，能與Phosphatidylserine (PS) 高親和力特異性結合。將Annexin-V進行螢光素(FITC、PE)或生物素(biotin)標定，以標定的Annexin-V作為螢光探針，利用流式細胞儀或螢光顯微鏡可檢測細胞凋亡的發生。
為何可以這樣做的原因是，細胞凋亡早期細胞膜有外翻的現象，而PS在正常細胞是位於細胞膜的內側，當外翻現象發生時PS就會曝露在細胞膜外側，利用Annexin-V及PS的專一結合的特性偵測細胞是否處於細胞凋亡初期階段，故PS的外翻被視為初期的指標之一。
此染色法通常會搭配Propidine iodide核酸染劑(PI)共同染色，原理在於細胞凋亡初期細胞外翻外會影響膜通透性的改變，正常活細胞不會攝入PI，但死亡的細胞及進行凋亡的細胞會將PI攝入進入細胞核與染色體結合。
中後期偵測
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DAPI染色法
細胞凋亡的中後期，利用簡單的DAPI核酸染劑直接細胞染色就可以觀察到細胞核形態上的變化，完整型態的細胞核染染色後是完整飽滿的，但細胞凋亡的細胞其細胞核型態如同多個泡泡狀的集合體，到最後期核會裂解更小的泡泡，稀疏分散於細胞當中，此方法最為經濟快速，但缺點是需要主觀判斷。
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Apoptosis DNA ladder片段分析
病毒遭遇非宿主細胞或是藥物或蛋白(TNF-a)的處理後，細胞會走向extrinsic apoptosis，最後當然是caspase-3 activated Dnase (CAD)造成染色體整個被切碎 (當然，intrinsic apoptosis也是)，這時要證實遭受刺激物細胞時走向細胞凋亡還是細胞壞死的途徑，可以直接萃取總體的核酸來進行電泳分析，因為在電泳圖所看到典型的DAN ladder片段，以約180 bps的倍數形成，隨著越後期的細胞凋亡過程，其片段化會越來越明顯；為何是180 bps的倍數，原因在於纏繞於histone上的DNA並無法被CAD切斷，僅會切在核小體(nucleosome)之間的DNA，而纏繞於核小體上的DNA片段就是約180 bps。此法也是經濟快速，但缺點是萃取總核酸時若因手法不純熟將大片段的DNA弄斷了，造成DNA smear導致跑膠的同時遮蔽了DNA ladder的訊號，無法正確判斷。
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TUNEL assay法
細胞凋亡進行中, 染色體DNA雙鏈斷裂或單鏈斷裂而產生大量的3'-OH sticky end，可在deoxynucleotidyl transferase (TdT)的作用下，將dUTP和螢光素(如FITC)、過氧化物酶、AP或biotin形成的衍生物標記到DNA的3'-末端，從而可進行凋亡細胞的檢測，這類方法稱為Terminal-deoxynUcleotidyl transferase mediated Nick end Labeling法 (TUNEL)。由於正常的或正在增殖的細胞幾乎沒有DNA的斷裂，因而沒有3'-OH形成，很少能夠被染色。
TUNEL實際上是分子生物學與形態學相結合的研究方法，對完整的單個凋亡細胞核或凋亡小體進行原位染色，能準確地反應細胞凋亡典型的生物化學和形態特徵，可用于石蠟包埋組織切片、冰凍組織切片、培養的細胞和從組織中分離的細胞的細胞形態測定，並可檢測出極少量的凋亡細胞，因而在細胞凋亡的研究中被廣泛採用。
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Caspase colorimetric assay法
另外，整個時期的偵測還可以針對caspase家族蛋白的表現量利用colorimetric assay來偵測特定casapse，如caspase3、8及9。其原理是caspase被活化後會辨識特定的胜肽序列切割，利用此特性，在特定胜肽序列後接上呈色劑或是螢光標定，測定吸光值或螢光強度，就可以比較個別caspase活性的高低變化，判定此細胞所走的細胞凋亡路徑是走extrinsic pathway(Caspase 8)或是intrinsic pathway(Caspase 9)。
方法還有很多不一一說明，還是根據自己的研究方向及設備還有實驗設定選擇合適的方法來做分析喔。初期驗證可以選擇簡單的方式先看到現象再選擇可量化的方法來數據化解釋所看到的現象，如看到DNA ladder或是DAPI染色看到泡泡化的細胞核，再選擇精確的TUNEL assay及Caspase colorimetric assay法來更加佐證先期實驗的證據，這樣的研究流程才不會浪費太多時間及經費。
