Eukaryotic RNA-Seq(Transcriptome)
RNA Sequencing (RNA定序, RNAseq)分析細胞內所有的mRNA，基於高通量定序的數據量，除了得知轉錄體 (Transcriptome)的變化，找出差異基因之外，還可以深入分析SNP、InDel、Alternative Splicing的改變，甚至預測Novel genes或是Transcripts的存在。
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樣品需求
1. RNA 總量：
1. Illumina 平台定序：≧ 2 μg 2. RNA 濃度：≧ 50 ng/ ul
3. 樣品體積：≧ 40 ul
2. 樣品純度及片段完整性： OD260/OD280：1.8 ~ 2.0
OD260/OD230：≧ 2.0
RIN 值：≧ 6.8 (動物樣本)；≧ 6.3 (真菌或植物樣本)
建議先行以電泳膠圖確認片段大小及RNA完整度，並於送件時提供膠圖結果
1. Illumina 平台定序：≧ 2 μg 2. RNA 濃度：≧ 50 ng/ ul
3. 樣品體積：≧ 40 ul
2. 樣品純度及片段完整性： OD260/OD280：1.8 ~ 2.0
OD260/OD230：≧ 2.0
RIN 值：≧ 6.8 (動物樣本)；≧ 6.3 (真菌或植物樣本)
建議先行以電泳膠圖確認片段大小及RNA完整度，並於送件時提供膠圖結果
定序規格
NovaSeq 6000 , paired-end 150 bp
採樣建議
樣品建議：
| 血液樣本
新鮮 / 冷藏保存全血：使用 EDTA 採血管收取 5 mL (建議 10 mL)。
Buffy coat：0.5 mL (建議分離自 5-10 mL 全血)，分離後以 -80 度保存及運送。
| 動物組織樣本
新鮮或冷凍組織檢體：100 mg (建議 200 mg)，-80 度保存及運送。
| 細胞樣本
細胞株樣本：1x10^6~1x10^7 cells，-80度保存及運送。
| 植物組織樣本
新鮮組織或幼苗的嫩葉/嫩芽，取 0.5 g - 1 g 進行萃取，完成 RNA 萃取後送件。
多醣多酚類含量高的植物，後續需要較多的核酸純化步驟，建議取到 4 g 進行萃取，完成 RNA 萃取後送件。
其它注意事項：
- 全血樣品避免使用玻璃材質且需加入 EDTA 抗凝劑，由於溶血作用會嚴重影響 RNA 萃取效率，運送過程的搖晃有高機率造成溶血，建議採血後盡速完成 RBC lysis 處理，或是 Buffy coat 分離，若必須運送請保持 4 度避免搖晃和冷凍。
- 取樣操作需在冰上進行，避免樣本的凍融，全程操作器械預先進行 RNase free 處理，採集後將樣本分割成100 mg左右的小塊，並立即放入預冷 RNAlater 按照使用手冊逐步冷凍，保存管使用 parafilm 封口，-80℃ 保存。
- 若採樣組織 RNA 表現量不高，適情況增加收取樣本量，確保萃取核酸足夠 RNAseq 使用。(例：脂肪、骨頭等組織。)
- 細胞收取前，可先用 RNase free 預冷 PBS 輕微沖洗細胞表層，移除懸浮死細胞和多餘培養液，並使用預冷 TRI reagent 沖洗方式收取細胞，並使用 pipetting 方式確實均質溶液後 -80℃ 保存。
- 植物樣本採樣時，須排除可能的環境微生物/昆蟲汙染，若水生/潮濕環境生長植物，必要時需要進行抗生素培養。
