【單細胞全長RNA定序】10x Genomics X Pacbio的結合

【單細胞全長RNA定序】10x Genomics X Pacbio的結合

近年來，10x Genomics的單細胞平台因為高通量的設計、回收率高以及完整的分析流程而成為了單細胞定序平台的龍頭角色，因此小編在過去也提供了諸多的10x Genomics相關的訊息與大家分享。然而，這樣的平台存在著一個最大的短板：那就是只針對mRNA的3’或5’端進行定序，因此無法提供isoform或等位基因(allelic RNA)方面的資訊。為了克服這樣的侷限，同時伴隨著三代定序通量的提升以及價格的降低，於是開始有科學家把腦筋動到了單細胞的全長RNA定序身上，以期利用這樣的技術來獲得更多有用的資訊。

在「Combined single-cell gene and isoform expression analysis in haematopoietic stem and progenitor cells」這篇preprint的這篇文章中，作者就結合了10x Genomics與PacBio平台來進行單細胞的全長RNA定序，藉此了解在老鼠的模式物種中，伴隨著老化的過程中，於造血相關的細胞中，基因表現的變化情況。

研究中，作者先利用FACS分別從8週與72週的老鼠血液中將感興趣的細胞群分離出來


(Lineage negative, cKit/Cd117 positive, LK)。將所得的8000顆細胞利用10x Genomics的平台進行單細胞的反應，接著將所得到的cDNA進行二代的3’cDNA sequencing與PacBio Sequel II (三代定序) 的Full-length cDNA sequencing。


【10x Genomics/Illumina】
在二代平台的定序結果中，作者將LK cell population進一步的分成15個subclusters，同時也發現伴隨著老鼠老化的過程中，於LK cell中，有許多的基因在表現量上會出現差異。

而在這15個細胞群中，作者也發現LT-HSC (Cd201 positive)會大量的累積在老化老鼠的造血細胞中，同時也發現Sult1a1與Nupr1這兩基因只會表現在老化的細胞中，說明這兩個基因可以作為此細胞類型的cell marker。




【10x Genomics/PacBio】
在三代平台的實驗中，作者將所得的帶有10x Barcode的全長cDNA利用PacBio進行定序，並得到17.9 million的CCS reads。這些reads的長度中位數落在1471 bases，藉由比對的結果，每個樣品中平均可以比對到16,427種genes，涵蓋33,345條transcripts，每條transcript平均可以比對到31條reads，且這些transcripts的平均coverage也到達74%。


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此外，因為此篇研究所用的10x系統是3’的版本，因此在短片段定序的結果中，是無法得到VDJ等基因重組的相關資訊。但在長片段的定序平台中則完全的克服了這個侷限。結果顯示，在老化的老鼠血液細胞中，IgK gene會大量的表現，且藉由VDJ gene的pattern也可以發現在老化的老鼠中，免疫細胞的clone type會跟年輕的老鼠有明顯的差異。此例子說明藉由長片段的定序技術，可以大大的補強於不同的細胞中，基因表現差異的解析度。


【原文連結】
Combined single-cell gene and isoform expression analysis in haematopoietic stem and progenitor cells
https://doi.org/10.1101/2020.04.06.027474