26
2021．05
【Nanopore定序應用於小基因體組裝－文獻分享】
原創文章 引用請註明出處
想像我們要拼一組拼圖，10片拼圖與100片拼圖的拼裝時間與所費心力，照常理來說，拼10片拼圖較輕鬆、出錯率較低。將三代定序長讀長的特性應用於基因體的組裝，就跟拼拼圖一樣，組裝起來較二代定序更為容易。除此之外，三代定序較二代定序更容易偵測結構變異、定序重複序列以及高G/C區域，而Nanopore即時定序、可攜性、彈性高等特性，使得很多小基因體研究都用其作為定序工具。本篇文章中將舉例幾篇文獻，讓大家更了解三代定序在小基因體組裝上的應用。
#1 組裝高G/C序列細菌基因體
#2 組裝高重複序列寄生蟲基因體
#3 組裝環狀病毒基因體
#1 組裝高GC序列細菌基因體 (PMID: 33355531)
Mycobacterium Kubicae為非結核性分枝桿菌，此類細菌因其序列G/C比例高，以及高度反向重複序列，在過去二代定序結果中，無法組裝成完整基因體序列。本篇文獻中，合併三代定序建構細菌基因體的主要框架，並且用二代定序數據進行序列校正，定序了兩個從臨床肺泡沖洗液中分離出的檢體，該分離菌已先經由rpoB locus Sanger sequencing確認為Mycobacterium Kubicae。定序結果分別產生15萬及29萬個reads，使用了3個及27個contigs組成完整的細菌基因體和細菌中的共9個載體。接著，加上先前4個已發布非完整基因體序列，拼湊出Mycobacterium kubicae的泛基因體(Pan-genome)，包含7,353個基因。這些基因與人類疾病、細菌防禦力、細菌代謝相關。這篇是第一篇將Mycobacterium Kubicae完整序列拼湊出來的研究。
#2 組裝高重複序列寄生蟲基因體 (PMID: 31218350)
克魯氏錐蟲為寄生蟲的一種，會引起人類恰加斯病，又稱為南美錐蟲病。因其一半以上的重複序列，使得過去使用二代定序一直無法得到完整基因體序列。在本篇文獻中，作者比較了合併二代+三代定序與單純使用二代定序的檢測結果。先以組裝效果來看，發現合併三代的使用，其最長contig的長度可增加34倍(從26,836 bp增加至926,516 bp)、contig組裝數目可以降低50倍(從46,821降至923個)。其N50值也從659 bp增加至156,193 bp。整體來說，組裝連續性增加了67倍，完整性提高了28%。從定序未覆蓋區域來看，二代定序未覆蓋的定序區域最長為6,156 bp，共3,624個區域。而二代+三代定序結果，未覆蓋的定序區域最長為1,781 bp，數量為54個區域，其組裝效果是明顯改善的。
#3 組裝環狀病毒基因體 (PMID: 33922452)
最後一篇文獻使用三代定序技術定序環狀DNA病毒，定序以Rolling Circle Amplification (RCA)或PCR製備的病毒基因體，並且以Sanger定序結果作為標準答案去對照其準確性。定序結果發現檢體中含兩株同屬於Capulavirus Trifolium virus 1的病毒TrV1-B、TrV1-C。而不管是RCA或者是PCR製備的上樣檢體，其三代定序結果與Sanger定序比起來，皆有99%以上的一致性。證明了三代定序可用來定序環狀DNA病毒，除了其準確度足夠外，對於可定序樣本的多樣性也是較彈性的。
以上舉例了幾篇
Nanopore的文獻，包含了定序高G/C序列的非結核性分枝桿菌、高度重複序列的克魯氏錐蟲，以及不同放大方式的環狀DNA病毒，驗證了三代定序除了長讀長的特性外，克服了許多二代定序的難點，使得基因體組裝有更好的結果。此外，在第三篇文獻中講到的，利用RCA方式放大病毒基因體，這種方法在恆溫30度之下即可進行，對於前處理的儀器需求上更是簡約。搭配Nanopore即時定序的特性，對於疫情爆發地區或是感染的即時偵測，更是一大突破。
參考資料
1. Hendrix, Jo, et al. "Intraspecies plasmid and genomic variation of Mycobacterium kubicae revealed by the complete genome sequences of two clinical isolates." Microbial Genomics 7.1 (2021).
2. Díaz-Viraqué, Florencia, et al. "Nanopore sequencing significantly improves genome assembly of the protozoan parasite Trypanosoma cruzi." Genome biology and evolution 11.7 (2019): 1952-1957.
3. Ben Chehida, Selim, et al. "Nanopore sequencing is a credible alternative to recover complete genomes of geminiviruses." Microorganisms 9.5 (2021): 903.
想像我們要拼一組拼圖，10片拼圖與100片拼圖的拼裝時間與所費心力，照常理來說，拼10片拼圖較輕鬆、出錯率較低。將三代定序長讀長的特性應用於基因體的組裝，就跟拼拼圖一樣，組裝起來較二代定序更為容易。除此之外，三代定序較二代定序更容易偵測結構變異、定序重複序列以及高G/C區域，而Nanopore即時定序、可攜性、彈性高等特性，使得很多小基因體研究都用其作為定序工具。本篇文章中將舉例幾篇文獻，讓大家更了解三代定序在小基因體組裝上的應用。
#1 組裝高G/C序列細菌基因體
#2 組裝高重複序列寄生蟲基因體
#3 組裝環狀病毒基因體
#1 組裝高GC序列細菌基因體 (PMID: 33355531)
Mycobacterium Kubicae為非結核性分枝桿菌，此類細菌因其序列G/C比例高，以及高度反向重複序列，在過去二代定序結果中，無法組裝成完整基因體序列。本篇文獻中，合併三代定序建構細菌基因體的主要框架，並且用二代定序數據進行序列校正，定序了兩個從臨床肺泡沖洗液中分離出的檢體，該分離菌已先經由rpoB locus Sanger sequencing確認為Mycobacterium Kubicae。定序結果分別產生15萬及29萬個reads，使用了3個及27個contigs組成完整的細菌基因體和細菌中的共9個載體。接著，加上先前4個已發布非完整基因體序列，拼湊出Mycobacterium kubicae的泛基因體(Pan-genome)，包含7,353個基因。這些基因與人類疾病、細菌防禦力、細菌代謝相關。這篇是第一篇將Mycobacterium Kubicae完整序列拼湊出來的研究。
#2 組裝高重複序列寄生蟲基因體 (PMID: 31218350)
克魯氏錐蟲為寄生蟲的一種，會引起人類恰加斯病，又稱為南美錐蟲病。因其一半以上的重複序列，使得過去使用二代定序一直無法得到完整基因體序列。在本篇文獻中，作者比較了合併二代+三代定序與單純使用二代定序的檢測結果。先以組裝效果來看，發現合併三代的使用，其最長contig的長度可增加34倍(從26,836 bp增加至926,516 bp)、contig組裝數目可以降低50倍(從46,821降至923個)。其N50值也從659 bp增加至156,193 bp。整體來說，組裝連續性增加了67倍，完整性提高了28%。從定序未覆蓋區域來看，二代定序未覆蓋的定序區域最長為6,156 bp，共3,624個區域。而二代+三代定序結果，未覆蓋的定序區域最長為1,781 bp，數量為54個區域，其組裝效果是明顯改善的。
#3 組裝環狀病毒基因體 (PMID: 33922452)
最後一篇文獻使用三代定序技術定序環狀DNA病毒，定序以Rolling Circle Amplification (RCA)或PCR製備的病毒基因體，並且以Sanger定序結果作為標準答案去對照其準確性。定序結果發現檢體中含兩株同屬於Capulavirus Trifolium virus 1的病毒TrV1-B、TrV1-C。而不管是RCA或者是PCR製備的上樣檢體，其三代定序結果與Sanger定序比起來，皆有99%以上的一致性。證明了三代定序可用來定序環狀DNA病毒，除了其準確度足夠外，對於可定序樣本的多樣性也是較彈性的。
以上舉例了幾篇Nanopore的文獻，包含了定序高G/C序列的非結核性分枝桿菌、高度重複序列的克魯氏錐蟲，以及不同放大方式的環狀DNA病毒，驗證了三代定序除了長讀長的特性外，克服了許多二代定序的難點，使得基因體組裝有更好的結果。此外，在第三篇文獻中講到的，利用RCA方式放大病毒基因體，這種方法在恆溫30度之下即可進行，對於前處理的儀器需求上更是簡約。搭配Nanopore即時定序的特性，對於疫情爆發地區或是感染的即時偵測，更是一大突破。
參考資料
1. Hendrix, Jo, et al. "Intraspecies plasmid and genomic variation of Mycobacterium kubicae revealed by the complete genome sequences of two clinical isolates." Microbial Genomics 7.1 (2021).
2. Díaz-Viraqué, Florencia, et al. "Nanopore sequencing significantly improves genome assembly of the protozoan parasite Trypanosoma cruzi." Genome biology and evolution 11.7 (2019): 1952-1957.
3. Ben Chehida, Selim, et al. "Nanopore sequencing is a credible alternative to recover complete genomes of geminiviruses." Microorganisms 9.5 (2021): 903.
圖爾思生物科技 / 微生物體研究中心
許瑄珉 文案
