17 2024．06

2024 Oxford Nanopore Technology年度技術更新大追蹤

關注Nanopore三代定序的朋友們，2024 London calling 已於 5/24 盛大落幕，今年同時也是 ONT 的十周年慶，對於Nanopore這個發展快速的定序平台，相信大家對每年的技術更新、突破等發表跟小編一樣既興奮又期待。趕快讓我們一起來看看 Nanopore 產品創新技術長 Clive G Brown今年展示給大家的各項技術進化重點，以下簡單摘錄各項突破發展的內容：

1. 鹼基辨識 (Basecalling) 架構優化，準確率再升級

sup-v5.0.0--Super accuracy basecalling (SUP) 模式的深度學習模型由 CNN-LSTM 更換為 transformer，幫助增加 simplex 和 consensus 序列的準確度。
sup-v5.0.0 模式下的 simplex 讀序準確度由 Q24.5 上升至 Q26 (99.75% 正確率)。
在 variant 研究中使用 sup-v5.0.0 模式進行 basecalling，後續 indel 召回及準確率均上升約 15%。
Dorado 0.7.0 basecaller 支援 single-read error correction 新功能，可將讀序中的錯誤鹼基進行校正，讓 simplex 準確度可達到平均 Q40。

2. Nanopore-only telomere to telomere (T2T) 定序組裝完整染色體基因體

使用 4 片 PromethION R10.4.1 晶片定序組裝完整的 T2T genome，包含使用 2 片晶片進行 ultra long reads 定序並搭配 single-read error correction 功能提高鹼基品質；1 片晶片進行 assemble polish kit (APK，使用 6B4 技術) 定序；及 1 片晶片進行 pore-c (染色質構相捕獲技術) 定序。這項組合式試劑套組預計將於今年 7 月上線，有相關研究需求的夥伴們可以持續關注。

上文提到的 6B4 技術指的是6 base being code by 4 signal，APK 試劑套組在 PCR 試劑中額外加入 A’ 及 T’ 兩種修飾核苷酸，可以提升定序時電訊號的穩定性，以增加序列中 tandem repeat 或 homopolymer 序列的鹼基辨識正確性，APK 定序後產出之 consensus 序列準確度可由 Q40 提升至 Q50。
為了達成一次一條讀完整個染色體，直接省去組裝步驟，ONT 設計在核酸萃取時保留組織蛋白或是萃取後再加入重組組織蛋白，以維持超長讀長染色質 DNA 的穩定性，定序時 motor protein 可以在序列過孔同時去除組織蛋白，得到較完整的染色體序列。這項技術目前仍在開發測試中，讓我們期待明年的 London Calling 是否有更多的進展。

3. 定序準確度優化及直接 RNA 定序 (direct RNA sequencing) 的各項優化

DNA 定序使用 remora 分析工具搭配 dorado 0.7.0 basecaller 讓甲基化分析準確度再提升， 5mC 99.38%、5mC/5hmC 97.87%、6mA 97.52% 及 4mC 96.33%。

Direct RNA sequencing kit (SQK-RNA004) 配合 sup-v5.0.0 basecalling 模式，準確度由 Q14.5 上升至 Q18.8。
SQK-RNA004 優化，建庫時間將可縮短 20 分鐘，並可抓取更長的 RNA 序列達 900 bp 以上，定序總時長將有效延長，定序 14 小時後晶片依然維持良好的 pore occupancy，同時增加約 20% 的數據產出。(即將上市)
RNA 上亦有許多化學修飾或是多連體的結構，在鹼基通過奈米孔道時會因此有訊號位移的情形發生，現行 basecaller 已可校正 G-quadruplex 定序時的時間位移，定序準確率在 m6A 可達 97.12%，pseudoU 可達 97.62%。
短片段 RNA 定序功能，軟體更新後可讀取 50 nt 以上的序列，讓 tRNA、降解 RNA 及破碎 RNA 等短片段可被定序，並在此功能需求下可穩定產出數據。(即將上市)

4. 硬體設備更新

MinION Mk1D: 新一代攜帶型定序儀，可透過 USB type C 接頭與 iPad pro、MAC、或是電腦連接使用，改善設備溫控穩定度後，於極端環境下可維持溫度在 10-35℃，讓環境符合定序最佳溫度。今年夏天將提供今年 London Calling 參與者提前體驗的機會。
MKⅡ: 新系列定序儀目前開發中，規格將介於 Flongle (2.8 Gb) 與 MinION (48 Gb) 之間，擁有更小晶片及機身，且可直立式放置最大利用空間，數據量可達 5-10 Gb，也將會有單個或多個 (8 個) 插槽設計讓使用者自由選擇。
TraxION: 簡易型萃取及定序儀，一機完成樣本萃取、準備及定序，簡化實驗流程且減少耗材使用，不需要多台儀器即可完成 ONT 定序，機器開發中。
ElysION: 全自動建庫及定序儀，從樣本製備至數據分析一機包辦，定序平台可搭配 MinION Mk1D 或是 PromethION 2 Solo，後續數據分析使用內建 EPI2ME 完成，全程避免人為操作時的任何汙染。