RNAi是一種天然的基因沉默(silencing)現象，最早在線蟲中被發現，是由短片段RNA(siRNA)調控mRNA導致基因靜默的作用，它存在於所有的真核生物之中，包括原生生物、真菌、藻類、植物與動物，調控內原基因表現與抵抗外源核酸入侵的自我保衛機制，被認為是最初作為抗病毒的免疫機制之一。
主要是藉由非小編碼RNA(Small non-coding RNA，sncRNA)來調控mRNA，造成降解、抑制轉錄等，使得mRNA無法轉譯成蛋白質的轉錄後基因靜默作用（post transcriptional gene silencing, PTGS）。

 

RNAi可以分為外源性與內源性2種，外源性有siRNA/shRNA與內源性的miRNA:

1. siRNA作用機制
 外源性dsRNA誘導的siRNA作用機制如下步驟:

（i）細胞吸收外源dsRNAs後，核酸內切酶(Dicer)迅速將其剪切成長約20-30個核甘酸的，5’有一個磷酸基團，3’有一個羫基突出2個核苷酸的siRNAs，正反股是完全互補配對。
（ii）siRNAs的被納入AGO2蛋白質中，形成一個siRNA誘導沉默複合物（siRNA-induced silencing complex，siRISC），siRISC中的siRNA經AGO2作用分解成兩條單股，正股被釋放出去，反股則留在siRISC中。
（iii）最後，含有反股的siRISC分子，在反股的siRNA指引下，透過鹼基互補的方式與目標基因結合，進而誘導目標基因silencing，從而實現轉錄後基因沉默（PTGS）。PTGS發生後，siRISC會與目標基因被釋放，尋找其他目標基因並結合，持續誘導新的目標基因沉默。

2. shRNA作用機制
  外源性shRNA轉染進細胞後誘導產生siRNA的作用機制如下步驟:

（i）利用病毒感染或者細胞轉染方式將shRNAy載體送入目標細胞，細胞核內經由RNA聚合酶 (Pol Ⅱ/Pol Ⅲ)轉錄得到pri-shRNA，pri-miRNA具有5’Cap、3’ poly（A）tail與一個或數個loop的RNA，長達約為數百個鹼基大小。
（ii）pri-miRNA會被RNA核酸酶(Drosha Ribonuclease III, Drosha)去除5’Cap與3’ poly（A）Tail含有loop，長約50-70個鹼基的pre-shRNA
（iii）pre-shRNA會從核內被運送到細胞質，被Dicer切成程度約20-30個核甘酸的，5’有一個磷酸基團，3’有一個羫基突出2個核苷酸的siRNAs，正反股是完全互補配對。
（iv）siRNAs的被納入AGO2蛋白質中，形成一個siRNA誘導沉默複合物（siRNA-induced silencing complex，siRISC），siRISC中的siRNA經AGO2作用分解成兩條單股，正股被釋放出去，反股則留在siRISC中。
（v）最後，含有反股的siRISC分子，在反股的siRNA指引下，透過鹼基互補的方式與目標基因結合，進而誘導目標基因silencing，從而實現轉錄後基因沉默（PTGS）。PTGS發生後，siRISC會與目標基因被釋放，尋找其他目標基因並結合，持續誘導新的目標基因沉默。

3. miRNA作用機制
  內源性miRNA誘導的基因沉默機制如下步驟:

（i）細胞核內miRNA基因在RNA聚合酶(Pol Ⅱ/Pol Ⅲ)轉錄得到pri-miRNA，pri-miRNA具有5’Cap、3’ poly（A）tail與一個或數個loop的RNA，長達數千到數萬個鹼基不等的長度。
（ii）pri-miRNA會被RNA核酸酶(Drosha Ribonuclease III, Drosha)去除5’Cap與3’ poly（A）Tail含有loop，長約70個鹼基的pre-miRNA，且是5′具有磷酸基團，3′具有羥基並突出2 個鹼基，正反股是部分互補配對。
（iii）pre-miRNA會從核內被運送到細胞質，被Dicer切成程度約19-25個鹼基的雙股miRNA duplex
（iv）miRNA duplex會與AGO1結合，形成一個miRNA誘導沉默複合物（miRNA-induced silencing complex，miRISC），miRNA duplex正股會馬上被降解，反股miRNA則會保留在miRISC中。miRISC在反股miRNA的指引下藉由鹼基互補方式來辨別目標基因，進而降解或沉默目標基因。

A. 三者的最終功能性型態都是長度在19-30核甘酸的small RNA，siRNA是3’有兩個游離的羫基，5’有磷酸基團的dsRNA，shRNA經過加工形成siRNA，miRNA則最終形成單股RNA。
B. siRNA一般是人工合成的linear dsRNA，shRNA、miRNA則是通過hair loop結構形成的雙股RNA。siRNA和shRNA的雙股是完全互補配對，而miRNA則是以部分互補的形式作用。
C. shRNA和miRNA的有類似的生成路徑，但shRNA在功能上與siRNA更接近。shRNA在細胞內被Dicer酶切割後形成siRNA，通過siRNA途徑行使干擾功能，而miRNA則是通過另一條不同的途徑調控目標基因。
D. shRNA以載體形式存在，能長時間在細胞內進行基因調控，shRNA可持續轉錄生產siRNA，半衰期可達數周至一個月以上，siRNA與miRNA送入細胞後馬上就會作用，半衰期相對較短，只有24-48小時，無法長時間作用，只能短暫影響細胞表現。 
E. siRNA與miRNA在細胞內的濃度是會隨著mRNA數量和轉染效率影響，隨著時間的增加逐漸減少，而shRNA可通過對啟動子的誘導調控來控制表達量，並能夠持續表達。

1. siRNA: 實驗者所使用細胞便於轉染或電穿孔，著重在實驗週期，快速觀察到目標基因抑制表現，或者想通過螢光或其他分子標記檢測mRNA等。
2. shRNA: 實驗人員想徹底沉默目標基因，或者想通過誘導在特定時期產生干擾效應，或者想建立穩定表現的細胞株，或者植物基因等。
3. miRNA: 內源非編碼的miRNA調控研究，miRNA對某表現所有調控路徑的影響，目標基因不能夠被完全沉默，否則會導致細胞死亡，如housekeeping基因等。

 

◆ 特殊化學修飾，提升細胞內的穩定性與轉染效率，更不容易被降解、作用時間更持久。
◆ 規格多元，提供各式實驗套組選擇，滿足in vitro與in vivo的實驗需求。
◆ 多種shRNA vector及Lentivirus shRNA vector可供免費選擇。
◆ 獨家RNAi合成套組方案，未達抑制效果未達70%以上，無條件換貨。

想了解更多嗎?>> 圖爾思RNAi合成服務


Reference: