【代謝體技術分享】多體學研究：胎兒與母體，早產預測
【代謝體技術分享】多體學研究
母體除了提供胎兒所需的營養外，胎盤[1]、陰道[2]、母乳[3]內的微生物都影響著胎兒的成長與腸道菌群的組成。本次分享於2021年發表於《Nature Communication》，有關母體陰道菌與早產的文章[4]。
為什麼要關注陰道菌？
健康的腸道，通常保有豐富的菌群組成。但你知道健康的陰道，需要保有低多樣性的菌群組成嗎？ Lactobacillus species的豐度多寡，被作為陰道是否健康的指標。陰道菌組成多樣性若增加，可能導致陰道相關疾病的產生，比如：HIV、宮頸發育不良、流產以及本篇研究的重點－早產。
早有研究已知陰道菌與早產有關，作者想探討的其實是...
目前陰道健康的檢測方法抱括：外觀觀察、Swab樣本顯微鏡觀察、次世代定序檢測...等。耗時、耗費、樣本處理繁雜，無法藉由這些方法快速、精準觀察宿主與陰道微生物間的關係。
是否有更快速、更簡便的方式找到Biomarker作為預測與治療的方法？
本篇的另一個亮點脫附電噴灑游離質譜法(Desorption Electrospary Ionization Mass Spectrometry, DESI-MS)。利用此方法不需進行繁雜的樣本處理手續，樣本僅有部分區域受損，同一個樣本剩餘的區域能再進行其他的體學，比如：16S定序、免疫蛋白測定...等)。 DESI-MS相較於傳統質譜法(LC-MS 或 GC-MS)，更適合應用於臨床生物標識的檢測。
DESI-MS主要檢測代謝物質，為了解陰道代謝物與陰道菌群和宿主免疫反應之間的關係，驗證代謝物與陰道菌群和免疫反應便是本篇的目的。
實驗設計
作者收集2個獨立的樣本集(VMET, n=160；VENT II, n=205)，皆為懷孕的母體，使用Swab收集陰道黏液進行代謝體、微生物鑑定(16S rRNA Seqencing, V1-V3 [VMET] and V1-V2 [VMET II])、免疫因子檢測的實驗。實驗設計參考文獻Figure 1A。
Figure 1A. 實驗設計流程
陰道菌群與代謝物
前述有提到，健康的陰道菌群保有低多樣性，主要表現菌種為Lactobacillus species，在兩個樣品集中，共365個樣品，進行16S rRNA定序和DESI-MS 代謝物鑑定。
首先在16S rRNA的定序結果中，OTU的結果將樣本明顯分為11個組別，並利用Silhouette scores計算，最終將菌群分成Community State Types (CSTs) 的單位，最終得到6個CSTs。
- CST I (L. crispatus)
- CST II (L. gasseri)
- CST III (L. iners)
- CST IV (Gardnerella vaginalis)
- CST V (L. jensenii)
- CST VII (other Lactobacillus spp.)
等等，怎麼少了 CST VI ?
這是因為CST VI僅在樣本及VMET2，作者解釋可能原因為這兩個基因及使用的Primer set。 但沒關係，這不影響我們前面描述落落長的OTU結果。最主要跟大家說明：
這幾個CST可以再根據是否為Lactobacillus-dominated，分為兩大組：Lactobacillus-dominated (LDOM) 和 Lactobacillus-depleted (LDEPL)，而各自包含的CST如下：
- LDOM: CST I, II, III, V, and VII
- LDEPL: CST IV and VI
接下來我們來看看在LDOM和LDEPL這兩組樣本的代謝物結果，見Figure 1B，不論在哪個樣本集，皆能明顯看出圖中113個代謝物的表現量能區別出LDOM和LDEPL兩群樣本。
Figure 1B. DESI-MS代謝物檢測結果
其中作者特別指出了幾個在LDOM和LDEPL各別表現顯著的代謝物，如Figure 1C 所示，Thiomalic acid 和 Leucyl-serine在LDOM的表現量較高，而Docosanoic acid 和 Lignoceric acid在LDEPL的表現量較高。
Figure 1C. 代謝物在LDOM和LDEPL的表現量
宿主免疫反應與代謝物
共檢測樣本集VMET II，22種免疫因子，可見下圖的代謝物與免疫因子有強烈的相關性，尤其是Long-chain fatty acids, Glycerophospholipids 和 Ceramidesm (Figure 4B)。
Figure 4B. 宿主免疫因子(Top10)與代謝物(Top23)的相關性
驗證宿主免疫、陰道菌群與代謝物的關係
終於！最後要來驗證在這所有樣本中，是否LDEPL的母體，是否發生早產的機率較高，其免疫因子表現量是否較高？
在本文中，定義母體是否早產，依據是否在胎兒成長 <37週前生產。可見圖中紅色標示為早產(preterm)，LDEPL樣本發生早產的比例較LDOM高，且免疫因子的表現量在LDEPL早產樣本也較高 (Figure 5A-C)。
Figure 5A-C. 陰道菌群不穩定性與免疫激活對早產的影響
子宮頸環紮術材料與早產
子宮頸環紮術(Cervical Cerclage)，主要針對子宮閉鎖不全的女性所進行的手術，防止胎兒有流產狀況發生。但這樣的手術會使得宮頸的長度變短，增加細菌感染的風險，進而也增加了胎兒早產的風險。 本篇另一個亮點為，針對子宮頸環紮術所使用的兩種材料(Braided suture material 和 Monofilament suture)，進行手術前後菌群、代謝物、免疫因子與早產的比較，結果發現，使用Braided suture material提高免疫因子活化與早產的機率 (Figure 5D-F)。
Figure 5D-F. 子宮頸環紮術對陰道菌群不穩定性與免疫激活所造成的不良影響
總結
本篇使用DESI-MS，開發更快速的方法預測孕婦早產的風險，同時了解陰道微生物-宿主免疫間的交互作用與代謝物的關聯，進而以代謝物作為新的生物標識。未來，DESI-MS能更廣泛的應用於其他女性陰道相關疾病的篩檢用途。
參考文獻
[1] de Goffau, M. C., Lager, S., Sovio, U., Gaccioli, F., Cook, E., Peacock, S. J., ... & Smith, G. C. (2019). Human placenta has no microbiome but can contain potential pathogens. Nature, 572(7769), 329-334.
[2] Feehily, C., Crosby, D., Walsh, C. J., Lawton, E. M., Higgins, S., McAuliffe, F. M., & Cotter, P. D. (2020). Shotgun sequencing of the vaginal microbiome reveals both a species and functional potential signature of preterm birth. NPJ biofilms and microbiomes, 6(1), 1-9.
[3] Moossavi, S., Sepehri, S., Robertson, B., Bode, L., Goruk, S., Field, C. J., ... & Azad, M. B. (2019). Composition and variation of the human milk microbiota are influenced by maternal and early-life factors. Cell host & microbe, 25(2), 324-335.
[4] Pruski, P., Correia, G. D., Lewis, H. V., Capuccini, K., Inglese, P., Chan, D., ... & MacIntyre, D. A. (2021). Direct on-swab metabolic profiling of vaginal microbiome host interactions during pregnancy and preterm birth. Nature communications, 12(1), 1-14.
