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2022．07
精準、快速、簡單-LAMP檢測大師
COVID-19的影響
由於2019年新冠肺炎的大爆發，並在這疫情爆發的段時間以來，qRT-PCR為全世界公認的標準檢測病毒的方法，但萬萬沒想到COVID-19的快速突變與強大的感染能力，導致檢測速度趕不上感染速度，一度造成不少國家醫療體系的崩潰與醫護人員人力不足的現象。為了減輕醫療負擔，台灣也緊急授權(EUA)抗原快篩試劑 (antigen rapid test)的開發與生產，以協助民眾可以自行自我篩檢，一般約15分鐘即可以得知結果，但這種方法學是透過免疫分析法(immunoassay)，不像PCR可以將訊號放大，因此靈敏度相對較低，此外大部分的抗原快篩試劑都是偵測Nucleocapsid Protein核殼蛋白(抗原)，因此有可能會和具有類似的抗原結構的病毒有交叉反應的風險，造成較高機率產生偽陰性/偽陽性的結果。我們該如何找到既精準、又高靈敏、能媲美快篩試劑的檢測速度的方法呢？讓小編來為大家隆重介紹：「恆溫環狀擴增法，LAMP」。
什麼是LAMP?
PCR是目前最常使用的核酸擴增技術，儘管他具有高靈敏度(sensitivity)與特異性(specificity)，但仍然有使用上的極限，因PCR操作起來較為複雜，對儀器和人員的技術要求較高，尤其溫度的調控更加的嚴格，因此不適用於快速診斷或田野調查。然而在2000年由日本學者Notomi博士[1]與他的團隊於Nucleic Acids Res期刊發表了全新的基因診斷技術，也就是本篇的主角LAMP (Loop-mediated isothermal amplification)。LAMP反應需要2對primers，如圖一所示，分別是outer primer (F3, B3)、inner primer (FIP, BIP)，相較一般PCR只需使用1對primer。其中primer必需針對目標序列的特異區加以設計，確保目標物的專一性。除了設計primer以外，還需要加入Bst DNA polymerase，他是一個具有5'→ 3'DNA聚合酶活性，以及很強的鏈置換 (strand displacement)活性，且能夠在60~65度的恆溫溫度下作用，根據M.M.Parida與他的團隊證明，透過LAMP方法學，DNA能夠在一小時內可以擴增到109[2]。P.R.Sahoo與他的團隊也發現，若需要增加擴增的效率，可以增加第3對primer，loop primer (LF, LB)，可將loop primer annealing在F1/F2、B1/B2區域，來加速DNA的生合成[3] 。
圖一、LAMP application流程圖
LAMP偵測原理
當LAMP成功擴增DNA則會釋放出焦磷酸根(Pyrophosphate)，會和反應中的溶液鎂離子(Mg2+)產生不溶於水的焦磷酸鎂(Magnesium Pyrophosphate)白色沈澱物。因此LAMP除了可以用肉眼的方式判斷之外，也可搭配螢光試劑觀察DNA擴增的情況。相較於PCR原理，LAMP的反應時間不到1小時就可利用肉眼的方式判讀。表一為LAMP與PCR之間的差異：
LAMP的應用
到目前為止LAMP這項技術已經被廣泛應用，並且有不少疾病也開發出商業用產品，供人們檢測使用。過去人類會因食物中的沙門氏菌、彎區桿菌、大腸桿菌等細菌污染，造成嘔吐、腹瀉、腸胃炎等症狀，因此可透過LAMP來檢測可能的感染源；而在臨床應用上因病毒感染所引起的疾病，如嚴重呼吸道症候群(SARS)、流感病毒(Influenza)等，相關的檢測試劑也有被開出來；而在已開發中國家，因未該國家醫療資源不足，常伴隨著流行疾病，如肺結核(Tuberculosis)、愛滋病(HIV)等，因此能夠在醫療資源匱乏的國家，非常適合使用LAMP的檢測試[4]。
而近年來因COVID-19的爆發，不少研究人員與機構也開發出，用於COVID-19診斷的LAMP檢測原型。Lamb等人，第一個開發出能在30分鐘內有效檢出COVID-19，並且測試不同的病源來證明LAMP的高特異性；而El-Tholoth等人的COVID-19 Penn-RAMP方法，證明不管是比色(colorimetric)或螢光(fluorescence)檢測都有達預期的檢測目的，並且測試純化後的target其性能和傳統的RT-PCR靈敏度高十倍；為了進一步提高靈敏度與昂貴的樣品製備步驟，Anahtar MN等人利用TCEP/EDTA和熱介導的裂解的化學RNase失活讓LAMP靈敏度提高30%，同時也將低了病毒的傳染性，與降低實驗室人員的風險；Broughton JP等人將RT-LAMP與CRISPR-Cas12診斷方法結合，利用COVID-19的DNA Endonuclease-Targeted CRISPR Trans Reporter (DETECTR)，基於CRISPR的分析考慮人類細胞中沒有病毒的相關基因，來提高檢測效率。[5]
想必你對於LAMP這項技術有更進一步的了解，並且開始躍躍欲試，想利用這項技術開發出屬於你自己的檢測試劑。但在前期材料準備，是不是需要花費時間、金費來準備呢？關於這一點你不用擔心，圖爾思這邊也提供了LAMP技術的相關產品，操作既簡單又省時，只需要透過肉眼觀察顏色的變化，便能夠快速檢測病毒(virus)與病原體(micro pathogen)的產品！
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Reference:
1. Notomi T, Okayama H, Masubuchi H, Yonekawa T, Watanabe K, Amino N, Hase T. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Res. 2000 Jun 15;28(12):E63.
2. 2. M.M.Parida,S.Sannarangaiah,P.K.Dash,P.V.L.Rao,K.Morita,Loop mediated isothermal amplification (LAMP): a new generation of innovative gene amplification technique; perspectives in clinical diagnosis of infectious diseases, Rev.Med.Virol.(2008),doi:10.1002/rmv.593.
3. 3. P.R.Sahoo,K.Sethy,S.Mohapatra,D.Panda, Loop mediated isothermal amplification: an innovative gene amplification technique for animal diseases, Vet.World9(2016)465–469,doi:10.14202/vetworld.2016.465-469.
4. Mori Y, Notomi T. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP): a rapid, accurate, and cost-effective diagnostic method for infectious diseases. J Infect Chemother. 2009 Apr;15(2):62-9. doi: 10.1007/s10156-009-0669-9. Epub 2009 Apr 25. PMID: 19396514; PMCID: PMC7087713.
5. Chaouch M. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP): An effective molecular point-of-care technique for the rapid diagnosis of coronavirus SARS-CoV-2. Rev Med Virol. 2021 Nov;31(6):e2215. doi: 10.1002/rmv.2215. Epub 2021 Jan 21. PMID: 33476080; PMCID: PMC7995099.
6. Collins RA, Ko LS, So KL, Ellis T, Lau LT, Yu AC. Detection of highly pathogenic and low pathogenic avian influenza subtype H5 (Eurasian lineage) using NASBA. J Virol Methods. 2002 May 16;103(2):213-25. doi: 10.1016/s0166-0934(02)00034-4. PMID: 12008015.
7. Böhmer A, Schildgen V, Lüsebrink J, Ziegler S, Tillmann RL, Kleines M, Schildgen O. Novel application for isothermal nucleic acid sequence-based amplification (NASBA). J Virol Methods. 2009 Jun;158(1-2):199-201. doi: 10.1016/j.jviromet.2009.02.010. Epub 2009 Feb 14. PMID: 19428591.
