單細胞定序 新知分享-Smart-seq3: 單細胞RNA定序的思考新方向
近年來，單細胞定序技術的突飛猛進帶動了在細胞發育與再生醫學、腫瘤微環境、免疫學相關研究、藥物開發、精準醫療等不同領域中重大的突破與發現。在這樣的趨勢下，也造就了單細胞定序平台百家爭鳴的現象，其中又以10x Genomics的單細胞平台因為高通量的設計、回收率高以及完整的分析流程而扮演著龍頭的角色，因此兔編在過去也提供了諸多的10x Genomics相關的訊息與大家分享。然而，這樣的平台仍然存在著極限：1. 只針對mRNA的3’或5’端進行定序，因此無法提供isoform或等位基因(allelic RNA)方面的資訊；2. 只涵蓋了約20-30%的mRNA。因為這樣的侷限，於是開始有科學家把腦筋動到了單細胞的全長RNA定序身上，以期利用這樣的技術來獲得更多有用的資訊，而今年五月發表在Nature Biotechnology期刊上的Smart-seq3就是基於原有的Smart-seq2進行改良與優化後所研發出來的單細胞全長RNA定序平台。
【Smart-seq3 建庫與組裝原理】
從建庫的原理流程來看，其建庫方式基本上與smart-seq2相同，最大的不同點在於在Tn5-Tag後面接上了UMI序列，其建庫流程如下：
1. 通過oligo-dT priming將mRNA反轉錄成全長的cDNA，並通過TSO (template-switching oligo)在cDNA的5’-end加上Tn5-tag-UMI的序列結構。
*TSO組成：Tn5 motif 11 and a novel 11-bp tag sequence, followed by an 8-bp UMI sequence and three riboguanosines.
2. 透過PCR反應來進行cDNA的擴增。 3. 藉由Tn5 based的Tagmentation反應將cDNA切成大小不一的片段，並進行建庫與定序。 4. 利用5’-end帶有UMI序列的片段定序結果來進行全長RNA的拼接。
利用這樣的技術，作者針對369個老鼠fibroblast cells進行分析後發現，在其所得到的數據中，有200000個組裝後的分子其長度大於1Kb，其中有22196個分子其長度甚至在1.5Kb以上。此外，此技術在每個細胞中平均可以偵測8710個RNA分子，且長度大於500bp。 
另外，在這369個老鼠細胞的數據中，此技術可以明確的的比對到不同的RNA isoforms、strand-specific alleles等資訊。 
Smart-Seq3雖然不是真的如三代定序一樣針對全長的RNA進行定序，但藉由與PacBio的數據比對後作者發現，兩個不同平台所偵測到的RNA分子中有54302個是一致的，佔PacBio所偵測到的RNA分子中的46%。而且從Col1a2這個基因的mRNA (全長2.3Kb) 來驗證，PacBio的定序結果是2.267Kb，而Smart-Seq3平台拼接後的長度則是1.9Kb。
而當將此技術應用在較為複雜的人類的檢體中(PBMC)後，作者也可以根據所得到的定序結果將細胞區分為不同的cell type。而且在所得的mRNA分子中，也可以分別對應到不同的isoform與allelic RNA，顯示此平台雖然仍無法像PacBio或Nanopore等三代定序平台一樣直接針對全長的RNA進行定序，但藉由組裝的方式，此平台已能克服現行主流的單細胞定序平台無法提供isoform資訊的侷限，且同時能涵蓋較多比例的RNA分子，藉此提供更多有用的訊息。
【原文連結】
Single-cell RNA counting at allele and isoform resolution using Smart-seq3
https://www.nature.com/articles/s41587-020-0497-0#Sec25
圖爾思生物科技 / 微生物體研究中心
