如何製備ELISA實驗中的標準曲線(standard curve)

在進行ELISA實驗中最重要的就是製備一條好的標準曲線(standard curve)，但是如何建構一條好的標準曲線呢？以及製備標準曲線的細節為何？今天就和世界知名的ELISA專家 "Boster" 生物科技公司一同攜手為您說個明白。

ELISA檢測原理中，為了確定檢測物的濃度，您需要將樣品的檢測結果與已知量的一組標準品進行比較。而您的分析中的標準品應在一系列濃度下進行測試，從而產生從基本不可檢測到最大訊號的數據。標準品的這組結果可以建構可以預測的標準曲線而這組標準曲線就可視為分析的理想數據。生成標準曲線後，可以輕鬆地查看檢測樣本所在曲線的位置以內差法算出檢測數值。

那麼如何準備這條標準曲線呢？一般來說ELSIA實驗都是通過標準品的連續稀釋來製備標準曲線，標準品應當跨越標準曲線範圍的已知濃度，且該範圍必須接近檢測樣品中的目標蛋白質濃度。下方的例子為建構濃度從3.9-2000pg/ml的標準曲線。
 
因此我們可以發現建構依條好的標準曲線除了標準品本身的品質與濃度必需要確實與精準外，最重要的就是 "稀釋" 這件事情了，由於生物學實驗大部分都是非常微量的技術，因此只要一點點小差錯或是沒有注意到操作時的小細節往往就會造成得到的數據不夠精確或是不可信的巨大結果，正所謂手抖則亂大謀啊！因此這邊也跟各位分享在進行標準品 "稀釋" 該注意的地方：

• 建議進行兩倍或三倍稀釋
• 不要製備太少量的稀釋液(<2ul)
• 避免進行大規模的稀釋動作，如果稀釋倍數 <1:1000，請使用兩個步驟進行稀釋
• 準備足夠的稀釋液以確保準確性
• 必須製備一組含有樣品稀釋劑的對照組(negative control)
• 標準品溶液最好在2小時內使用完成
• 在不吸收蛋白質的eppendroff中進行所有稀釋動作以避免標準品有誤差
• 每次稀釋後使用新的tip

​上述的每個細節也許您聽到會想笑，那恭喜你，表示你已經擁有建構好的標準曲線的能力了。若沒平常沒有留意這些細節的話，也請你下次建構ELISA標準曲線時特別留意。

接著，一旦在ELISA reader上測量了每個well的強度後，就可以開始計算每個重複樣品的平均吸光值。然後透過每個樣品的平均吸光度（x軸）與標準濃度（y軸）的關係來生成標準曲線。通常標準曲線具有S形。

在上圖的範例中，標準曲線的線性區域很長因此 ELISA 實驗結果將非常準確且再現性高。目前，大部分的 ELISA reader 都內建生成標準曲線的程式，如果沒有，我們也可以使用Microsoft Excel或其他生成標準曲線的軟體來生成標準曲線和R2值 ，R2值表示數據與標準曲線的對應關係，因此R2值若等於 1 將是最完美的，但通常R2值>0.95時所產出的數據即具有生物統計上的意義，因此也不需要過於追求R2值的極限。計算過後，若檢測樣品濃度超過曲線的最高點或不在線性範圍內，我們建議在進行ELISA測量前要先進行檢測樣品稀釋的動作，若進行檢測樣品的稀釋動作，也請務必記得稀釋倍數以便日後進行回推。記得，在ELISA實驗中標準曲線代表一切，沒有好的標準曲線就不可能有好的ELISA實驗結果。我們共勉之~

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