03
2019．10
如何建立研究用的細胞模型
細胞為進行科學研究時常用的模型之一，往往是科學研究進入動物研究模式前的階段，細胞研究模型的建立相對動物模式來說也相對簡單與單純。圖爾思在這邊就為大家整理幾種常見的細胞研究模型的建立方式：
以下為常見細胞刺激實驗的條件設定原理，若針對每個研究主題或作用的細胞進行實驗時，還是要先行測試刺激物劑量的有效濃度及最佳作用時間區段才能進行後續實驗。
Staurosporine誘導Jurkat細胞:
當Jurkat細胞密度達到106/ml時，添加Staurosporine於培養基中達到最終濃度1 μM培養6小時，對照組則添加PBS。根據不同時間點收集細胞樣本後以Caspase 3或是Caspase 8抗體檢測其蛋白變化。
紫外線刺激HeLa細胞:
將HeLa細胞繼代後，待細胞密度達到80%時，打開培養皿上蓋後放置於無菌操作台內打開UV燈照射2小時或是置於UV Stratalinker 1800中設定UV為0.24 J自動設定照射時間，對照組則不照射。刺激完成後以Caspase 12或Caspase 9抗體檢測其變化。
Tunicamycin誘導PC-3 細胞:
Tunicamycin是誘導內質網壓力的常用誘導劑。誘導前24小時繼代細胞，使細胞密度達70%-90%，隔日加入Tunicamycin誘導，誘導濃度分別為2 μg/ml及4 μg/ml，培養24小時，對照組加入等體積DMSO。收集細胞總蛋白後，以CHOP抗體偵測Phospho-Ubiquitin(Ser65)的蛋白量。
Thapsigargin誘導HepG2 細胞:
Thapsigargin為另一有效誘導劑。誘導前24小時繼代細胞，使細胞密度達70%-90%，使用Thapsigargin最終濃度1 μM刺激24小時，對照組加入等體積DMSO。以ATF4 ELISA 試劑套組檢測內質網壓力後ATF4蛋白的表現濃度變化。
發炎反應是個體對於刺激的一種防禦反應。病原菌的侵入或是壞死組織的分解產物等化學因素；溫度、放射線物質和物理性損傷等物理因素都可以導致發炎反應。在細胞實驗中可以利用化合物、重組蛋白等誘導細胞走向發炎反應的訊號途徑。
PMA 刺激 Jurkat 細胞:
Jurkat 細胞密度1.0 x 106 /mL，實驗組加入PMA使終濃度為10 ng/ml，對照組加入等體積DMSO，培養2小時。 收集細胞總蛋白。
LPS 刺激 HepG2 / U937 / THP-1 細胞:
刺激前24小時繼代細胞，使細胞密度達70%-90%，實驗組使用LPS終濃度為0.1 μg/ml刺激18-24小時，可選擇收集時間點，設置無刺激對照。
TNF-α 刺激 HUVEC 細胞:
刺激前24小時繼代細胞，使細胞密度達70%-90%，實驗組使用TNF-α終濃度為10 ng/ml 刺激18小時，設置無刺激對照。
PHA+LPS 共同刺激:
細胞密度0.5x106/ml，6-well plate每孔細胞總量1 x 106個，PHA終濃度10 μg/ml ，LPS終濃度 50 ng/ml ；刺激時間分別為：PHA 30分鐘+LPS 10分鐘；PHA 1小時 +LPS 0.5小時； PHA 1天 + LPS 2小時；PHA 2天 +LPS 1天；PHA 3天 +LPS 2天。
CD3 單抗刺激 Jurkat 細胞（T細胞活化）:
刺激時Jurkat 密度1.0 x 106 /ml，實驗組加入CD3單株抗濃度15 μg/ml，刺激6小時後收細胞，設置無刺激對照。
IFN-gamma 刺激 A375 / A549 / HeLa 細胞:
細胞密度1.0 x 106 /ml，IFN-gamma濃度15 μg/ml，刺激48小時後收細胞，設置無刺激對照。進行Western blot實驗，使用PD-L1 抗體和IDO1 抗體偵測二者蛋白變化。
細胞自噬是一個以膜包裹自身細胞質蛋白或細胞器而形成囊泡，與溶酶體(lysosome)融合形成自噬溶酶體(autolysosome)，降解其內容物的過程。細胞以達到自身的代謝需要和某些細胞器的更新。
無血清培養誘導HepG2及HEK293細胞:
HEK293 和HepG2 無血清培養基培養2 小時後換新鮮培養基，加入最終濃度為50 μM 的Chloroquine培養24小時； 對照組除了無加入50 μM 的Chloroquine外其餘條件相同。24小時後收集細胞總蛋白以LC3抗體進行免疫螢光染色（IF）實驗直接觀測自噬小體的數目或Western blot實驗檢測LC3-Ⅱ和LC3-Ⅰ的蛋白量變化。
Rapamune誘導293T細胞:
誘導前24小時繼代細胞，使細胞密度達70%-90%。實驗時加入終濃度分別為為20 nM、100 nM、500 nM 的Rapamune誘導293細胞 ，同時可以根據實驗需求分別收集時間點0、6、12、18、24小時的樣本；對照組實驗為添加PBS或Rapamune溶劑。以LC3抗體進行免疫螢光染色或是Western blot觀察細胞自噬的發生和變化。
CCCP誘導粒線體自噬:
誘導前24小時繼代細胞，使細胞密度達70%-90%，使用終濃度為10 μM CCCP作用24小時，對照組則添加DMSO(CCCP溶劑)。以Phospho-Ubiquitin(Ser65)抗體進行Western blot實驗偵測Phospho-Ubiquitin(Ser65)的蛋白量差異。
Nocodazole 刺激 HeLa 細胞:
Nocodazole 是常用的細胞中期阻斷劑，可以將細胞週期阻斷在M 期，使得細胞週期同步。加入Nocodazole終濃度為1 μg/ml 到密度為70% 左右的HeLa 細胞，分別培養16、24 及48小時後收細胞，對照組不刺激。
BrdU 刺激 HeLa 細胞:
BrdU是一種合成核苷，類似於Thymine (T)。它可以被使用到新合成的DNA(在S期，DNA複製過程中取代Thymine）。BrdU 被用於監測細胞增殖。在HeLa 細胞中加入作用濃度為0.03 mg/ml 的 BrdU，37℃培養2小時後收細胞固定，以2 M HCl 處理30分鐘，對照組不刺激。利用免疫螢光染色實驗利用BrdU 抗體偵測BrdU 的情況，BrdU 將聚集在細胞核中，表示被偵測到的為增殖後的細胞。
氯化鈣(CaCl2)刺激 EC109細胞:
作用前24小時繼代細胞，使細胞密度達70%-90%，加入最終濃度為0.06 mM及1.8 mM CaCl2 培養基分別培養0、3、5、7、10天收集細胞，之後進行Westren blot 實驗和免疫螢光染色實驗檢測ZNF750蛋白變化。
胰島素刺激HeLa 細胞:
胰島素可通過 mTOR 信號傳遞調控細胞週期和細胞增殖。。作用前24小時繼代細胞，使細胞密度達70%-90%，加入終濃度為100 nM胰島素作用15分鐘後收集細胞，設置無刺激對照。之後進行Westren blot 實驗偵測mTOR蛋白。
用油酸(Oleic acid)刺激細胞可以誘導細胞脂滴的形成。ADRP/Perilipin 2是脂滴的marker。透過免疫螢光染色 利用ADRP 抗體標定出含脂滴的細胞。
作用前24小時繼代細胞，使細胞密度達70%-90%，使用油酸終濃度為600 μM刺激19 小時，設置對照組。使用ADRP 抗體偵測該蛋白的在細胞中的定位。
低氧(hypoxia)刺激:
CoCl2是一種化學性低氧模擬劑，在細胞實驗中能模擬低氧狀況。作用前24小時繼代細胞，使細胞密度達70%-90%。使用終濃度為250 μM、400 μM的CoCl2 溶液分別刺激6 小時，對照組不加CoCl2 。以HIF1a 抗體檢測HIF1a，Western blot 驗證HIF1a 的蛋白是否顯著上升，同時於細胞的定位應由胞質向核內轉移。
過氧刺激:
以HeLa 細胞或HEK293 細胞為測試細胞；使用利尿酸（ethacrynic acid，EA）刺激細胞產生緊迫。作用前24小時繼代細胞，使細胞密度達70%-90%，加入終濃度為100 μM的EA刺激5小時後收樣，設置無刺激對照。刺激之後，以TDP-43抗體偵測TDP43 ，結果應顯示TDP-43 蛋白被磷酸化(50 kDa)，並被剪切成TDP35 的磷酸化片段(35 kDa)。
相信上面的說明應該可以作為大家在建立細胞研究模型的參考。
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以下為常見細胞刺激實驗的條件設定原理，若針對每個研究主題或作用的細胞進行實驗時，還是要先行測試刺激物劑量的有效濃度及最佳作用時間區段才能進行後續實驗。
【細胞凋亡誘導】
要將細胞誘導進入細胞凋亡的程序主要有兩大方向，一是從細胞外添加誘導劑，二是將細胞照射紫外線，兩者分別誘發細胞凋亡的Extrinsic Pathway及Intrinsic pathway，無論哪種凋亡途徑都與Caspase蛋白家族的調控有關。Staurosporine誘導Jurkat細胞:
當Jurkat細胞密度達到106/ml時，添加Staurosporine於培養基中達到最終濃度1 μM培養6小時，對照組則添加PBS。根據不同時間點收集細胞樣本後以Caspase 3或是Caspase 8抗體檢測其蛋白變化。
紫外線刺激HeLa細胞:
將HeLa細胞繼代後，待細胞密度達到80%時，打開培養皿上蓋後放置於無菌操作台內打開UV燈照射2小時或是置於UV Stratalinker 1800中設定UV為0.24 J自動設定照射時間，對照組則不照射。刺激完成後以Caspase 12或Caspase 9抗體檢測其變化。
【內質網壓力(ER stress)誘導】
鈣離子調控失衡以及未摺疊蛋白聚集或者是內質網內部錯誤摺疊造成內質網壓力，將造成Caspase12誘導的細胞凋亡及未摺疊蛋白反應(UPR)等。在內質網壓力發生時，相關蛋白如ATF4 和CHOP 的表達量會發生顯著變化，故這些蛋白可作為此現象的的標靶蛋白。Tunicamycin誘導PC-3 細胞:
Tunicamycin是誘導內質網壓力的常用誘導劑。誘導前24小時繼代細胞，使細胞密度達70%-90%，隔日加入Tunicamycin誘導，誘導濃度分別為2 μg/ml及4 μg/ml，培養24小時，對照組加入等體積DMSO。收集細胞總蛋白後，以CHOP抗體偵測Phospho-Ubiquitin(Ser65)的蛋白量。
Thapsigargin誘導HepG2 細胞:
Thapsigargin為另一有效誘導劑。誘導前24小時繼代細胞，使細胞密度達70%-90%，使用Thapsigargin最終濃度1 μM刺激24小時，對照組加入等體積DMSO。以ATF4 ELISA 試劑套組檢測內質網壓力後ATF4蛋白的表現濃度變化。
【發炎反應刺激】
發炎反應是個體對於刺激的一種防禦反應。病原菌的侵入或是壞死組織的分解產物等化學因素；溫度、放射線物質和物理性損傷等物理因素都可以導致發炎反應。在細胞實驗中可以利用化合物、重組蛋白等誘導細胞走向發炎反應的訊號途徑。PMA 刺激 Jurkat 細胞:
Jurkat 細胞密度1.0 x 106 /mL，實驗組加入PMA使終濃度為10 ng/ml，對照組加入等體積DMSO，培養2小時。 收集細胞總蛋白。
LPS 刺激 HepG2 / U937 / THP-1 細胞:
刺激前24小時繼代細胞，使細胞密度達70%-90%，實驗組使用LPS終濃度為0.1 μg/ml刺激18-24小時，可選擇收集時間點，設置無刺激對照。
TNF-α 刺激 HUVEC 細胞:
刺激前24小時繼代細胞，使細胞密度達70%-90%，實驗組使用TNF-α終濃度為10 ng/ml 刺激18小時，設置無刺激對照。
PHA+LPS 共同刺激:
細胞密度0.5x106/ml，6-well plate每孔細胞總量1 x 106個，PHA終濃度10 μg/ml ，LPS終濃度 50 ng/ml ；刺激時間分別為：PHA 30分鐘+LPS 10分鐘；PHA 1小時 +LPS 0.5小時； PHA 1天 + LPS 2小時；PHA 2天 +LPS 1天；PHA 3天 +LPS 2天。
CD3 單抗刺激 Jurkat 細胞（T細胞活化）:
刺激時Jurkat 密度1.0 x 106 /ml，實驗組加入CD3單株抗濃度15 μg/ml，刺激6小時後收細胞，設置無刺激對照。
IFN-gamma 刺激 A375 / A549 / HeLa 細胞:
細胞密度1.0 x 106 /ml，IFN-gamma濃度15 μg/ml，刺激48小時後收細胞，設置無刺激對照。進行Western blot實驗，使用PD-L1 抗體和IDO1 抗體偵測二者蛋白變化。
【細胞自噬誘導】
細胞自噬是一個以膜包裹自身細胞質蛋白或細胞器而形成囊泡，與溶酶體(lysosome)融合形成自噬溶酶體(autolysosome)，降解其內容物的過程。細胞以達到自身的代謝需要和某些細胞器的更新。無血清培養誘導HepG2及HEK293細胞:
HEK293 和HepG2 無血清培養基培養2 小時後換新鮮培養基，加入最終濃度為50 μM 的Chloroquine培養24小時； 對照組除了無加入50 μM 的Chloroquine外其餘條件相同。24小時後收集細胞總蛋白以LC3抗體進行免疫螢光染色（IF）實驗直接觀測自噬小體的數目或Western blot實驗檢測LC3-Ⅱ和LC3-Ⅰ的蛋白量變化。
Rapamune誘導293T細胞:
誘導前24小時繼代細胞，使細胞密度達70%-90%。實驗時加入終濃度分別為為20 nM、100 nM、500 nM 的Rapamune誘導293細胞 ，同時可以根據實驗需求分別收集時間點0、6、12、18、24小時的樣本；對照組實驗為添加PBS或Rapamune溶劑。以LC3抗體進行免疫螢光染色或是Western blot觀察細胞自噬的發生和變化。
CCCP誘導粒線體自噬:
誘導前24小時繼代細胞，使細胞密度達70%-90%，使用終濃度為10 μM CCCP作用24小時，對照組則添加DMSO(CCCP溶劑)。以Phospho-Ubiquitin(Ser65)抗體進行Western blot實驗偵測Phospho-Ubiquitin(Ser65)的蛋白量差異。
【細胞週期相關】
細胞週期的五個階段分別為：G0、G1、S，G2和M phase，調控著細胞的生長、分裂。細胞週期的調控刺激。Nocodazole 刺激 HeLa 細胞:
Nocodazole 是常用的細胞中期阻斷劑，可以將細胞週期阻斷在M 期，使得細胞週期同步。加入Nocodazole終濃度為1 μg/ml 到密度為70% 左右的HeLa 細胞，分別培養16、24 及48小時後收細胞，對照組不刺激。
BrdU 刺激 HeLa 細胞:
BrdU是一種合成核苷，類似於Thymine (T)。它可以被使用到新合成的DNA(在S期，DNA複製過程中取代Thymine）。BrdU 被用於監測細胞增殖。在HeLa 細胞中加入作用濃度為0.03 mg/ml 的 BrdU，37℃培養2小時後收細胞固定，以2 M HCl 處理30分鐘，對照組不刺激。利用免疫螢光染色實驗利用BrdU 抗體偵測BrdU 的情況，BrdU 將聚集在細胞核中，表示被偵測到的為增殖後的細胞。
氯化鈣(CaCl2)刺激 EC109細胞:
作用前24小時繼代細胞，使細胞密度達70%-90%，加入最終濃度為0.06 mM及1.8 mM CaCl2 培養基分別培養0、3、5、7、10天收集細胞，之後進行Westren blot 實驗和免疫螢光染色實驗檢測ZNF750蛋白變化。
胰島素刺激HeLa 細胞:
胰島素可通過 mTOR 信號傳遞調控細胞週期和細胞增殖。。作用前24小時繼代細胞，使細胞密度達70%-90%，加入終濃度為100 nM胰島素作用15分鐘後收集細胞，設置無刺激對照。之後進行Westren blot 實驗偵測mTOR蛋白。
【油酸(Oleic acid)刺激】
用油酸(Oleic acid)刺激細胞可以誘導細胞脂滴的形成。ADRP/Perilipin 2是脂滴的marker。透過免疫螢光染色 利用ADRP 抗體標定出含脂滴的細胞。作用前24小時繼代細胞，使細胞密度達70%-90%，使用油酸終濃度為600 μM刺激19 小時，設置對照組。使用ADRP 抗體偵測該蛋白的在細胞中的定位。
【氧含量變化刺激】
低氧環境可以增強呼吸強度，抑制生理運作；過氧化環境則會促進衰老。低氧(hypoxia)刺激:
CoCl2是一種化學性低氧模擬劑，在細胞實驗中能模擬低氧狀況。作用前24小時繼代細胞，使細胞密度達70%-90%。使用終濃度為250 μM、400 μM的CoCl2 溶液分別刺激6 小時，對照組不加CoCl2 。以HIF1a 抗體檢測HIF1a，Western blot 驗證HIF1a 的蛋白是否顯著上升，同時於細胞的定位應由胞質向核內轉移。
過氧刺激:
以HeLa 細胞或HEK293 細胞為測試細胞；使用利尿酸（ethacrynic acid，EA）刺激細胞產生緊迫。作用前24小時繼代細胞，使細胞密度達70%-90%，加入終濃度為100 μM的EA刺激5小時後收樣，設置無刺激對照。刺激之後，以TDP-43抗體偵測TDP43 ，結果應顯示TDP-43 蛋白被磷酸化(50 kDa)，並被剪切成TDP35 的磷酸化片段(35 kDa)。
【低溫刺激】
以HepG2 細胞為實驗材料。取相同培養條件的細胞和相同數量的細胞，在4℃（低溫）、25℃（常溫）、37℃（體溫）條件下培養1小時，隨後收集細胞總蛋白以CIRBP 抗體透過Western blot檢測CIRBP 的蛋白量差異。相信上面的說明應該可以作為大家在建立細胞研究模型的參考。
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