如何避免qPCR實驗中genomic DNA污染

定量即時聚合酶鏈鎖反應(Quantitative real time polymerase chain reaction，簡稱qPCR)。qPCR是藉由PCR擴增原理將目標核酸片段放大的同時並達到即時定量之結果，但大家在進行qPCR的實驗中往往會忽略genomic DNA污染所造成數據產出不真實的細節，因此我們特別針對這個重點跟大家分享在進行qPCR時關於genomic DNA污染的注意事項：
 

1. 萃取後的total RNA必須使用RNase free-DNaseⅠ來去除genomic DNA，若您是使用Trizol類試劑來進行樣品total RNA的純化時，所純化的total RNA會殘存較高的genomic DNA，特別是起始的細胞或是組織量過多而沒有使用足量的Trizol類試劑進行萃取total RNA時genomic DNA的殘存量就會更高。另外，經過DNaseⅠ處理後的RNA樣品還需要透過管柱清洗純化或是使用Phenol-Chloroform純化法來去除DNaseⅠ。目前市面也有許多產品在RNA管柱純化套組中會附上DNaseⅠ在沖提RNA前進行in-column digestion來去除genomic DNA。但因為DNase I的處理過程通常需要費時約30分鐘以上，所以目前市面上已經有廠商推出可以快速去除genomic DNA的配方，例如：TOOLSQuant II Fase RT Kit, TOOLS Easy Fast RT Kit...等均屬於這類新型的產品。
2. 在操作qPCR樣品混合時，最好是在專用的操作台(附有uv燈裝置可進行例行除汙)進行，使用專一套的微量吸取器及帶有filter的tip，避免氣溶膠帶來的外來DNA分子。若是不允許配置專用區域，所操作區域須定時以稀酸或是商品化的核酸去除噴劑清潔，尤其是離心機內，這是核酸污染的大來源，必須勤以清理。
3. 每次進行qPCR實驗時，放置一組不含任何DNA的陰性對照組，監控每次實驗是否有被核酸汙染，若發現有汙染，則須思考是否操作環境不潔需進行核酸的除汙。

 
以上皆是需注意的重點，當然去除RNA樣本中的genomic DNA是第一要務，這樣所定量的結果才能讓自已安心及信服啊。

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