兔單抗(Rabbit monoclonal antibody)製造技術全解析

提到單株抗體(monoclonal antibody, mAb)大部分的研究者第一個既定印象就是小鼠單株抗體(mouse monoclonal antibody, mAb)，經由雜交融合瘤細胞(hybridoma cell)生產小鼠單株抗體的技術從1975年由Georges Kohler 及 Cesar Milstein發展出來後已行之多年了，是個成熟且古老的技術，隨著科學家對抗體效能的需求與重視程度，直到最近才發展出兔單株抗體(rabbit monoclonal antibody)製造技術，且已經逐漸成為科研市場上的主流抗體，因為兔單抗不但具有專一性高、背景值低、應用性廣泛、可辨認更多新型的抗原位點…等優點，最重要的是兔單抗的重覆性非常高，這也是現今科研上對於抗體要求最重要也是最關注的重點。

今天幫大家整理了目前四種常見的兔單抗生產技術：

雜交融合瘤細胞技術(Hybridoma cell fusion technology)

將抗原分別兩次注射於小鼠體內後，等待B細胞成熟增殖並產出抗體後，初步採血確認有抗體產生，然後犧牲小鼠取出脾臟細胞與骨隨瘤細胞雜交融合，融合成功後將雜交融合瘤細胞單株化，並各別測試單株細胞的抗體效價及抗原辨識單一性，取得最佳的細胞株大量培養，收集所分泌出的抗體上清液即可純化濃縮單株抗體。

同樣的流程應該可以應用在兔單抗(rabbit monoclonal antibody)的製程，但兔子一直缺乏適合的骨髓瘤細胞進行雜交，同時兔-鼠的雜交融合瘤細胞不穩定。但事實上從1995年開始第一株兔融合雜交瘤細胞株240E-1發展後，到2006年的240E-W2的出現，兔單抗已開始應用在商業及科學研究上。雖然240E-W2具有專利，基於兔免疫系統具有出色的抗體辨識位(Epitope) 辨識能力，所以目前兔單抗的發展已經是熱門的技術研發主題。
 

噬菌體表現庫技術(Phage display assay)

      分子選殖技術發展出〝基因庫〞的概念後，噬菌體從單純的保有單一核酸片段形成一個總體基因庫的概念外，更可利用其外鞘蛋白將所嵌入的外來核酸表現成重組蛋白外露於噬菌體表面。這個概念被應用在scFv及Fab片段的選殖上，將抗體基因可變區域建構成噬菌體基因庫，由於重組噬菌體會將重組蛋白表現於外鞘上，再利用抗原蛋白與抗體高親和力結合的特性，選殖出具有專一結合的scFv或Fab序列的選殖株。但此技術最大的問題在於僅能保證蛋白與抗原間的高親和力結合，但由於缺乏真核系統的蛋白後修飾及正確的蛋白構型，並無法表現出可變區域基因重組的真實；此技術開始的關鍵點之一是基因庫的效價要很高，高效價的基因庫才有機會篩選到高親和力鍵結的單株抗體，最後操作此技術的分子選殖經驗很重要，整個操作流程複雜度與時序遠大於融合瘤細胞技術。
 

蛋白質體學與NGS資料庫的應用法

      此技術的應用概念可以用逆向工程的想法理解，直接從免疫過後的兔體取得周邊血後純化抗體，再以質譜儀的方式鑑定出胺基酸序列，得到此資訊後同時配合NGS定序後的資料庫進行交叉比對找出抗體間各別的核酸序列。這看起來非常簡單但實際上蛋白質譜所能提供的片段還必須排列組合，也就是輕鍊與重鍊蛋白的組合雖然可以用NGS資料庫先行預測得到基因序列，但還是需要進行蛋白表現後驗證，其技術成本不算低。
 

單細胞篩選及選殖技術

      利用多光譜流式細胞儀篩選兔周邊血的B細胞後，再將單一B細胞的重鍊與輕鍊基因選殖出來，這概念聽起來很簡單，是個直球的概念，但這卻是最耗費時間技術門檻最高以及高經費消耗的方法。單一細胞定序前必須取得其總RNA，取得RNA後，必須將重鍊及輕鍊基因放大，這時必須透過PCR增幅核酸的總量，但所需的增幅週期會超過50個cycle甚至更多，此時polymerase對點突變的修正還有其活性週期就是一個技術關鍵之一，若是出現突變後造成蛋白的domain改變有可能造成其抗體辨識能力的喪失；此方法還是需要進行重組蛋白質的表現及驗證，也是需要大量的技術能量及時間。

 
後期技術概念都是以選殖到正確的輕鍊及重鍊蛋白基因後，利用重組蛋白生產方式以期大量生產重組單株抗體，筆者早期也利用類似概念生產重組鼠單株抗體，原因是利用胎牛血清培養融合瘤細胞的成本太高，想以生產重組蛋白方式大量生產，故當初將以單株化的融合瘤細胞抽取其總RNA後，建構噬菌體基因庫後以抗原及原本單株抗體建立類似sandwich ELISA的方式選殖出單株化噬菌體後定序找出其重鍊及輕鍊序列，但如同前面所說必須進行親和力測試才能證實，證實結果重組抗體親和力與融合瘤細胞生產的抗體相比太低沒有生產應用價值故作罷。
 
總之目前兔單抗技術發展還在快速進化中，隨著科研對於抗體的品質要求逐漸提升，相信完美的兔單抗生產技術在不遠的將來將會被開發出來。

 
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