21
2018．08
生物學重複與定序深度在RNAseq研究中何者重要？
雖然目前定序成本已大幅下滑，但樣本間設置多少重複樣本的問題，仍讓我們面臨超出經費預算的尷尬。那麼在有限的預算下想要盡可能提高手上定序資料的利用價值，我們究竟該選擇定序深度還是樣本數目呢？
小編找了三篇具代表性的高引用文章，來說明雖然定序深度對偵測差異基因很重要，但當滿足一定的定序深度後，其提昇的效果會逐漸不顯著。
但若增加生物學重複數目後，對於發現差異基因的敏感度效果會高於定序深度的提升。並且，增加重複數亦可以減少實驗誤差，對提高結果的可靠性。
但若增加生物學重複數目後，對於發現差異基因的敏感度效果會高於定序深度的提升。並且，增加重複數亦可以減少實驗誤差，對提高結果的可靠性。
a．假陽性率：
提高定序深度或增加重複樣本數均可降低假陽性率。但是，在25%低表現的基因，隨著定序深度和重複樣本數的增加，假陽性率從無到有並逐步遞增；而在75%高表現的基因，假陽性率隨著定序深度和重複樣本數的增加卻呈遞減趨勢。
b．敏感率：
在表現量較低的基因中，當抽取5%的reads數和兩個重複樣本時，敏感率不到10%，抽取所有reads和重複樣本時，敏感率達到了100%；而對於表現量較高的基因，提高定序深度和樣本數對敏感率並無顯著影響。總體上，對表現量較高的基因，抽取5%的reads數和兩個生物學重複也能滿足90%的差異基因篩選率。
上圖(a)(b)為增加定序深度跟生物學重複比較發現差異基因的能力。當Reads的數目從2.5M增加到10M時，發現差異基因的能力（類似於敏感度）和數目都有顯著的提高，而Reads的數目大於10M時，敏感度就漸漸顯得疲軟。而增加生物學重複，對於發現差異基因的數目及能力則有顯著性的提升。
圖(c) 顯示的是不同Reads數目的ROC曲線，當Reads數目從2.5M增加到10M時，ROC曲線增加的很明顯，Reads數目從10M增加到30M時，ROC則沒有顯著的提高。
圖(d) 的縱軸表示logFoldChange的變異係數（ CV ），這個變異係數越小，說明fold change的值在不同重複間的重複性更好。同樣看到Reads數目從2.5M增加到10M時候，變異係數明顯減小，而Reads數目大於10M後，曲線的趨勢趨於平緩。而在相同定序深度時（例如10M reads），增加生物學重複對於變異係數的縮小比定序深度效果大很多。
上圖分別是以Cuffdiff2、DESeq與edgeR對三組datasets（MAQC / K_N / LCL2）做差異表現分析結果的ROC curve，橫軸表示假陽性率（ False positive rate ），縱軸是陽性率（ True positive rate )，簡單的說，陽性率越高，假陽性率越低越好。一般用ROC曲線下的面積（ Area Under roc Curve，AUC ）衡量ROC曲線好壞，AUC值越大，也就是曲線越靠近坐標軸的左上角，這條曲線越佳。
以(H)圖為例，對於只有一個生物學重複（1 rep），當假陽性=0.2時，陽性率≈0.55；對於兩個生物學重複（ rep =2 ），同樣假陽性=0.2時，陽性率≈0.75。因此可以發現，在假陽性不變的情況下，當生物學重複越多，陽性率越高。而當生物學重複增加到14時，AUC的增加還是很明顯的。
綜合以上：
(1) 樣本數對差異基因篩選的精確性造成的影響比定序深度更大，無論對於技術性重複還是生物學重複都適用。
(2) 對於低現量的基因，reads數和樣本數的選取對差異基因篩選存在著影響，而對於高表現量的基因，提高定序深度對差異基因的篩選實質幫助較小。
(3) 大於10M的Reads數目對差異表現分析是足夠的（在生物學重複大於等於3的情況下）。
因此，建議若已滿足一定的定序深度後，應優先選擇用多餘的研究經費增加生物學重複，以提升分析的可靠性。
參考文獻
[1] Rapaport, F., Khanin, R., Liang, Y., Pirun, M., Krek, A., Zumbo, P., et al. (2013). Comprehensive evaluation of differential gene expression analysis methods for RNA-seq data. Genome Biology, 14(9), R95.
[2] Liu, Y., Zhou, J., & White, K. P. (2014). RNA-seq differential expression studies: more sequence or more replication? Bioinformatics, 30(3), 301–304.
[3] Zhang, Z. H., Jhaveri, D. J., Marshall, V. M., Bauer, D. C., Edson, J., Narayanan, R. K., et al. (2014). A Comparative Study of Techniques for Differential Expression Analysis on RNA-Seq Data. PLoS ONE, 9(8), e103207–11.
(2) 對於低現量的基因，reads數和樣本數的選取對差異基因篩選存在著影響，而對於高表現量的基因，提高定序深度對差異基因的篩選實質幫助較小。
(3) 大於10M的Reads數目對差異表現分析是足夠的（在生物學重複大於等於3的情況下）。
因此，建議若已滿足一定的定序深度後，應優先選擇用多餘的研究經費增加生物學重複，以提升分析的可靠性。
參考文獻
[1] Rapaport, F., Khanin, R., Liang, Y., Pirun, M., Krek, A., Zumbo, P., et al. (2013). Comprehensive evaluation of differential gene expression analysis methods for RNA-seq data. Genome Biology, 14(9), R95.
[2] Liu, Y., Zhou, J., & White, K. P. (2014). RNA-seq differential expression studies: more sequence or more replication? Bioinformatics, 30(3), 301–304.
[3] Zhang, Z. H., Jhaveri, D. J., Marshall, V. M., Bauer, D. C., Edson, J., Narayanan, R. K., et al. (2014). A Comparative Study of Techniques for Differential Expression Analysis on RNA-Seq Data. PLoS ONE, 9(8), e103207–11.
圖爾思生物科技 / NGS事業部
郭育倫 文案
