siRNA的實驗技巧

這次將和大家分享siRNA實驗中大家常會遇到的問題與如何確認你設計的siRNA是否有抑制作用。

越來越多的科學家利用 siRNA 來研究細胞內蛋白質的功能，例如 : 細胞凋亡研究、蛋白質與蛋白質支間的交互作用、訊號傳遞等...，因此siRNA在生命科學研究中所扮演的角色常重要。siRNA是由20-25個核苷酸所組成的雙股RNA分子，進入細胞中經過一連串的細胞內酵素作用會形成單股的RNA，這些單股的RNA分子會和目標RNA進行序列的互補進而干擾基因的表現。因此在siRNA的實驗中很多關鍵都會影響其後續的效果以及實驗結果，圖爾思SuperLab為大家整理出下面幾項進行siRNA實驗的關鍵與解決方案 :

1. 如何設計一條好的siRNA?

a. siRNA的設計序列位點最好涵蓋start codon(AUG)或是位於stop codon附近50-100個序列附近，目的是要確保mRNA不能進行後續的蛋白質表達。

b. siRNA的序列起始要為 AA 以便在互補 siRNA 3' 端可以加上 dTdT 以提升siRNA被細胞內的核酸外切脢破壞。

c. siRNA的 GC 含量要低於50%(我們建議落在40-50%之間)。

d. siRNA的序列中避免連續3個或是3個以上的G或C的以避免siRNA本身形成二級結構。

e. 設計完成後務必進行BLAST以避免該 siRNA 發生 off-target 的現象。

f. 找尋一間可以提供高品質與設計建議的公司進行合成與確認。

>> 圖爾思siRNA合成服務

2. 影響siRNA效果的關鍵因素與實驗設計要點 :

a. 挑選一個好的轉染試劑(transfecton reagent) : 轉染效率在siRNA實驗室中扮演非常重要的角色，首先你必須確認你選擇的轉染試劑可以用於轉染小核酸分子，接著進行siRNA實驗室若可以最好選擇具有高轉染效率的細胞株進行實驗。我們建議最好挑選轉染效率能達到50%以上的細胞株進行該實驗。

b. 務必設計對照組 : 進行siRNA實驗務必設計對照組，務必設計對照組，務必設計對照組，因為非常重要所以我們得說三次，一般我們會使用帶有螢光(FAM of GFP)的陰性對照組siRNA來確認轉染效率，然後還會選擇一條抑制內源性基因的siRNA(通常是GAPDH)作為陽性對照以確保您選擇的siRNA合成公司的合成能力是沒有問題的，最後會選擇一條含有無意義(negative control siRNA)或是錯亂序列(scrambel negative control siRNA)的siRNA最為陰性對照。

c. 進行siRNA濃度測試 : 雖然一般siRNA合成公司都會有建議的使用濃度，但由於生物體是相當複雜的運作，因此我們還是會建議先進行濃度測試來選擇一個效果最佳的siRNA作用濃度來進行正式的實驗。

d. 選擇最佳的作用時間點 : 通常蛋白質分子越大其mRNA的半衰期就會越長，因此在正式實驗開始前，我們建議應先測試在哪個時間點siRNA的抑制效果為佳，確定後再進行正式實驗才能獲得最佳的條件得到最可信的結果。

3. 如何評估siRNA的抑制效果 :

b. 蛋白質方法驗證 : 一般我們可以使用Western blot 或是其它可以檢測蛋白質表達量的方法最為驗證，但若於蛋白質層級沒有發現表達量的差異並不表示siRNA沒有抑制效果，畢竟從 mRNA到蛋白質表達這中間還是有很多影響因素。

4. 我設計的siRNA需不需要進行修飾?

siRNA合成技術經過多年來的演進已經是一個非常成熟的技術，也已經發展很多於siRNA上的修飾方法，這些修飾方法無非都是要增強siRNA的抑制效果，常見的修飾方法有 : 甲氧修飾、LAN修飾、硫化修飾等，我們當然建議最好可以選擇具有修飾的siRNA能讓您的siRNA實驗更加順利。

以上，為圖爾思技術服務中心基於siRNA實驗經驗的豐富為您提出的建議。

>> 圖爾思siRNA合成服務