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2019．03
如何做長片段PCR(long PCR)
一般的PCR(這邊泛指使用一般的taq聚合脢)能擴增的長度大約為3~5kb左右，但若為了研究的方向而需要擴增大於5kb的片段時，我們應該怎麼完成呢？隨著技術的大幅度進步生技公司早已經發展出多種不同功能性的taq來因應使用者的需求，只是通常礙於各種因素要順利完成長片段的擴增也不是一件容易的事情。圖爾思基於對長片段PCR(long PCR)實驗的豐富經驗，在這邊告訴大家幾個進行長片段PCR你應該要注意的重要事項：
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Taq的選擇：
一般的taq具有較高的出錯率，因此在PCR的過程當中容易做出和DNA模版(DNA template)序列不完全100%一致的PCR產物，且一般的taq在擴增過程中於3'端非常容易出現促物的鹼基配對而導致taq無法繼續進行擴增作用(elongatino)因而無法得到較長且正確PCR產物，所以如何選擇適合用來進行長片段PCR的tag就是最重要的事情了。目前，市場上針對長片段PCR實驗推出的taq(例如：TOOLS ultra Hi-Fi taq, KOD、infusion taq...等)具有高保真度(fidelity)以及對於長片段擴增擁有較高的效能(例如：能擴增大於10kb)，因此當您要進行長片段PCR的實驗時請務必確認您選擇的taq必須要符合高保真度與長片段擴增能力這兩點，且保真度越高、長片段擴增能力越強絕對是完成長片段PCR的不二法則。建議可以參考TOOLS ultra Hi-Fi taq。
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你的DNA模版(DNA template)品質必須要很好：
一般來說我們會利用genomic DNA提取試劑盒來得到各式樣品的DNA模版，請你提取完成後務必確認不能含有太多的雜質或是提取的量必須足夠進行長片段PCR實驗(一般我們可以跑DNA電泳或是使用儀器檢測OD260和OD280的數值來進行品質的判定），前者若雜質太多或是提取後的溶液中含有太多影響PCR反應效能的物質時，則會導致PCR實驗的成功率大幅下降 ; 後者若得到的DNA模版量太少時則根本沒有足夠的模版去進行擴增，因此一個優質的genomic DNA提取試劑盒是非常重要的。圖爾思提供您最優值的genomic DNA extraction kit
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PCR反應溫度的優化：
若我們使用一般的PCR反應溫度來進行長片段PCR實驗時很容易導致PCR擴增過程中PCR產物的損壞或是斷裂，因此我們建議降低denature的溫度或是於反應中添加enhancer來促進擴增效能。
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primer的設計對了嗎？
用來進行長片段PCR實驗的primer我們建議比一般較長些，可以設計21~34個鹼基的primer來增加和目標序列的專一性以及便於降低anneling的溫度，讓PCR反應最佳化，當然primer的長度也不宜過長，因為過長的primer通常容易產生自身的二級結構而讓PCR反應效能降低。
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DNA模版本身的複雜二級結構過多時怎麼辦？
若您的DNA模版過長或是GC含量過高時，非常容易產生複雜的二級結構(可以利用軟體去預測)而導致PCR反應難以順利進行，此時我們建議可以於反應中添加少量的DMSO讓PCR反應能順利進行。
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全基因合成：
若試過任何方法都無法順利得到您的目標產物時，不妨建議您改用全基因合成，現在的全基因合成技術非常純熟與便宜，能在短時間內得到序列100%正確的DNA，在這邊也提供您另外一個選擇。
