如何設計好的qPCR probe

qPCR probe設計法則

在即時定量PCR(real-time PCR ; qPCR)技術當中，TagMan系統是使用螢光探針(probe)對於序列的專一性來偵測基因的表達量，因此相較於一般SYBR系統的qPCR專一性高很多，即便是一個鹼基無法配對 probe 也無法與其結合，所以非常適合用來進行 SNP 以及基因相關檢測。所以在TagMan系統中除了primer外，螢光探針(probe)是TagMan系統中非常重要的組成份之一，因此螢光probe的設計決定了實驗的成敗。圖爾思基於多年於qPCR實驗技術的經驗在這邊整理了幾個設計probe的重要規則：

1. probe設計的位置越接近上游的primer越好，最好probe與上游primer距離一個鹼基或是重疊為佳，但 probe 5' 端與 primer 5' 端要間隔至少4個鹼基。
2. probe的長度最好落在15~45個鹼基內，20~30個鹼基長度最佳。
3. 絕對要避免螢光probe本身產身二級結構而導致和目標序列結合總量降低。
4. Tm值落在65-70℃，建議比引物Tm值高5-10℃（至少5℃），GC含量在40%－70%為佳。目前主流為在 probe 加上 MGB 或是 LNA 修飾，如此可以大幅提昇 probe 的Tm值以提升專一性。
5. probe的5'端避免為G，因為 G 會激發螢光的表現導致假陽性訊號的產生。
6. probe的序列設計要能和目標序列完全互補，若真的無法完全互補，則建議將無法互補的鹼基安置在probe中間以避免影響probe和目標序列的結合。另外，probe序列中的GC含量最好為30~80%，且要避免重複4個一樣的鹼基連續出現。
7. 避免probe發生 off-target 的現象以避免偽陽性訊號發生。