【蛋白質表達】重組蛋白內涵體的復性策略

但大腸桿菌表達系統卻也因為高度表達的特性，可能會在培養過程中以較高的溫度培養、較高濃度的誘導劑或使用強力的啟動子系統(Strong Promoter)，加快蛋白質轉譯生產速度，造成錯誤摺疊或折疊不完整，容易產生不溶的蛋白聚合體，內涵體（inclusion bodies）。內涵體的產生與原核表現系統的蛋白生成機制有關，不像真核表達系統具有轉譯後修飾(post translational modification，PTM)、伴護蛋白(chaperone proteins)等幫助蛋白正確摺疊。目前形成內涵體機制還不清楚，但是可以利用內涵體不容易被蛋白酶降解與易沉澱、可以簡單利用離心蒐集的方式，我們可以容易蒐集到大量且高純度的重組蛋白，然後再利用體外溶解(solubilization)成變性狀態(denature)及再摺疊（refolding）的方式使蛋白質恢復活性。

包涵體要回復成有活性的天然蛋白(native proteins)，主要有4個步驟，分別是洗滌(washing)、溶解(Solubilization)、復性(refolding)與純化(purification)等，其中溶解與復性是最關鍵的步驟，分別說明如下:

• STEP1 洗滌(washing)

包涵體在溶解之前通常會先洗滌，主要去除大腸桿菌內的雜質，如DNA、RNA、膜蛋白等。通常利用低濃度的變性劑，如1-2M尿素(Urea)、1% Triton X-100。

• STEP2 溶解(Solubilization)

在包涵體中，重組蛋白都處於錯誤摺疊的狀態，要讓蛋白變性，就是要破壞非共價鍵的鍵結，像是離子間的相互作用力，如氫鍵(hydrogen bond)、凡得瓦力(van der Waals' Forces)、疏水力(hydrophobic bond)等並用還原劑(β-ME）打開雙硫鍵，使內涵體完全伸展為無摺疊的多肽鏈。常用的變性劑有6M 鹽酸胍(GuHCl)、8M尿素(Urea)、0.3% Sarkosyl(月桂醯肌氨酸鈉) or SDS(十二烷基硫酸鈉)

• STEP3. 復性(refolding)

是指藉由去除變性劑，使目標蛋白從完全伸展的變性狀態恢復到正常具有摺疊結構，同時去除還原劑讓雙硫鍵再形成，讓蛋白質恢復二、三級結構。目前常見的蛋白質復性方法有下列幾項:
 

A. 透析法(Dialysis) : 通過逐步降低外部透析液中變性劑的濃度，使透析袋內部變性劑的濃度也逐漸降低。需要耗時長，容易形成沒有活性的蛋白質聚合物，一般多為實驗室使用，不適合大規模工業應用。

B. 稀釋法(Dilution) : 將變性蛋白直接加入水或者緩衝溶液，降低變性劑濃度，使蛋白再重新摺疊，需要放置過夜，缺點是會增加體積，但方法最簡單有效、易操作。稀釋的蛋白終濃度一般控制0.01mg/ml以下，防止大量的蛋白沉澱的形成並提高回收率。

C. 分子篩過濾法(Size exclusion chromatography) : 利用管柱層析技術，膠體分子篩可將蛋白質和小分子變性劑分離，完成溶液交換和蛋白質的折疊復性。分子篩過濾能在高濃度得蛋白下進行復性，且回收的活性蛋白量也多，同時也有一定程度的純化效果。

• STEP4. 純化(purification)

重組蛋白的純化過程，一般常用的的分子篩（Size exclusion）、離子交換樹脂( Anion exchange)與親和性樹脂(Affinity)等層析方法，根據不同重組蛋白的特性，可分別選擇與其相對應的層析管柱來進行蛋白純化的工作。

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