08
2016．06
微生物分析系列報導: LEfSe分析
研究微生物多樣性時，常會使用一種稱為“進化分支圖”的方式來呈現，這是在16S研究中常見的分析表現形式。
LEfSe (Linear discriminant analysis (LDA) Effect Size) 是一種用於發現高維生物標記和篩選基因組特徵的分析演算法，能夠在組與組之間尋找統計上具顯著差異的生物標識（Biomarker），即組間在豐度上具有顯著差異的物種。此演算法強調的是統計意義和生物相關性。
圖1 16S LEfSe進化分支圖
以上圖為例：
- 在進化分支圖中，由內至外輻射的圓圈代表了由門至屬（種）的分類層級，在不同分類上的每一個小圓圈代表該水平下的一個分類，小圈圈的直徑大小代表其相對豐度大小。
- 著色原則：無顯著差異的統一著色為黃色，差異顯著的Biomarker跟隨分組色進行著色，例如紅色節點代表在紅色分組中起到重要作用的微生物類群。
- 圖中也會展示各Biomarker對應的物種名。
案例分析一 (Cell 2014)
青黴素LDP對小鼠腸道微生物的影響
研究中利用16S定序，以服用低劑量的青黴素(LDP)破壞小鼠的腸道微生物，研究LDP使用時間對小鼠腸道微生物及微生物的改變對代謝表現的影響。正常小鼠中，乳桿菌屬（Lactobacillus）佔優勢，隨著小鼠逐漸增長，其相對豐度相對減少。LDP小鼠中，Lactobacillus豐度水平明顯低於對照小鼠，且在其他物種中也存在顯著差異，LDP對多個物種都有影響，可以顯著降低理研菌科（Rikenellaceae）、分支絲狀桿菌（Candidatus Arthromitus，SFB)的豐度。研究中也利用宏基因組測序KEGG分析了代謝通路，研究證實了抗生素的使用對腸道微生物結構的破壞及其對宿主代謝的影響。
圖2 使用LDP的小鼠及對照小鼠LEfSe進化分支圖
案例分析二 (Nature 2015)
腸道微生物可以影響宿主表型
轉基因小鼠的表型差異一直難以被控制，許多案例中都表明，腸道微生物菌群是造成這種差異的原因之一。研究中選用小鼠的IgA高水平和低水平表型差異，利用16S V4測序結合LEfSe分析研究小鼠的腸道微生物菌群差異及與IgA水平的關係。兩種表型的小鼠腸道微生物菌群存在明顯差異，其中，低水平小鼠中，β變形菌（Betaproteobacteria）占主要優勢，而高水平小鼠中厚壁菌門（Firmicutes）等占主要優勢。研究中將低水平IgA小鼠的糞便移植到高水平IgA小鼠體內，發現高表達IgA小鼠IgA表達水平降低。此研究證實了腸道微生物可以影響宿主表型這一理論。
圖3 (a) IgA低水平小鼠的Biomarker LEfSe分析 (b) IgA高水平小鼠的Biomarker LEfSe分析
案例分析三 (Nature Communication 2014)
靈長類動物孕期高脂肪飲食影響其後代腸道微生物結構
腸道微生物是一個獨特的生態系統，在動物體代謝過程中發揮著重要的作用，對肥胖也有直接的影響。研究中利用16S技術研究了日本獼猴Macaca fuscata孕期高脂肪飲食對其後代腸道微生物的影響。通過LEfSe進化分支圖觀察到，高脂肪飲食和正常飲食獼猴後代之間微生物群落存在明顯的差異。 其中，螺旋體屬( Spirochaetes )可以作為正常飲食獼猴的腸道微生物的Biomarker，而產芽胞菌( Erysipelotrichi )、擬桿菌（Bacteroidetes）是高脂肪飲食泥猴的腸道微生物的Biomarker。新出生個體過早的給予高脂肪飲食，會導致腸道正常微生物彎曲桿菌（Campylobacter）豐度的降低，研究指出合理膳食對塑造良好腸道菌群微生物環境的重要性。
圖4 不同飲食獼猴後代腸道微生物結構
CTD：正常飲食組HFD:高脂肪飲食組
藍色為在HFD起到重要作用的顯著差異菌群，黃色為在CTD中起到重要作用的顯著差異菌群。
參考文獻
Cox LM, Yamanishi S, Sohn J, et al . Altering the intestinal microbiota during a critical developmental window has lasting metabolic consequences. Cell . 2014, 158(4): 705-721.
Moon C, Baldridge MT, Wallace MA, et al . Vertically transmitted faecal IgA levels determine extra-chromosomal phenotypic variation. Nature. 2015, 521(7550): 90-3.
Ma J, Prince AL, Bader D, et al . High-fat maternal diet during pregnancy persistently alters the offspring microbiome in a primate model. Nat Commun . 2014, 5: 3889.
圖爾思生物科技 / 諾禾致源文案
