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2016．09
預測下一個生技世代的風貌(三)： 蛋白質體學的即時掌握
儘管人類基因體已在 21 世紀初期完成定序圖譜，但是後來基因學家和生物研究人員逐漸發現基因體序列好比一張藍圖，僅能知道有什麼基因可能會表現，可是無法得知哪些基因被表現、在什麼時機表現、以及基因表現後的蛋白質修飾情形等等。這樣的氛圍帶動了蛋白質體學的興起。所謂蛋白質體，就是一個生物個體在特定時間當下所表現的所有蛋白質，而蛋白質體學則會利用各種工具探討這些蛋白質的種類、數量、分布、以及修飾情形 (如：裁切狀況、增添醣基、雙硫鍵結等)。目前蛋白質體學已可針對健康和發病組織表現的蛋白質體進行分析和比較，對於未來研究疾病起源、及早診斷病症、以及實現個人化治療將會有相當大的幫助。
認識蛋白質體學 (proteomics)
「蛋白質體 (proteome)」一字於 1994 年由澳洲遺傳學家 Marc Wilkins 在攻讀博士期間率先提出，是希望為人類蛋白質建立有如基因體 (genome) 定序一般的完整認知。Wilkins 教授後來也發展多項蛋白質分析工具，這些工具也成為蛋白質體學門戶網站 ExPASy (https://www.expasy.org/) 的主要骨幹。至 1997 年，「蛋白質體學 (proteomics)」的概念正式問世，也象徵生物學家開始直接檢測和分析生物體內的各種蛋白質成分和狀態，而不再從基因 (genomics) 或轉錄之訊息 RNA (transcriptomics) 的角度去推敲各種蛋白質是否真的有表現。不過蛋白質體的分析難度確實相當高，截至 2014 年 5 月才有德國和美國的團隊分別在 Nature 期刊發表人類的蛋白質體圖譜；但美國的圖譜涵蓋 17,294 種蛋白質 (估計占人類蛋白體的 84%)，德國的圖譜則包含 18,097 種蛋白質 (估計為人類蛋白體的 92%)，也就是說仍有將近一成的人類蛋白質還沒被發現，圖譜尚未完整，同志仍須努力！更有趣的是，這兩份圖譜共計有 193 個蛋白質是由「非基因」的 DNA 所表現，意味目前對基因的定義和認識並不完整，而未來加以闡明蛋白質體後，或許人類基因定序圖譜也必須隨之重新檢視和修正。
蛋白質體學的主要研究工具
蛋白質體學的研究主力目前為質譜儀 (mass spectrometry, MS) 和微陣列 (microarray)，這方面的主要儀器和試劑廠商包含美國的 Sigma-Aldrich、ThermoFisher Scientific、Bio-Rad、Agilent、 Affymetrix 等等。不過目前各路廠商的市占率均未超過 15%，甚至排名前十的廠商之市占率也未過半，表示蛋白質體學仍是勝負未定、值得逐鹿的藍海領域。台灣的圖爾思生技在近年也看準這樣的情勢，選擇於國內推出完整的蛋白質萃取、分離、標記、偵測、分析、和確認技術，可應用在蛋白質片段的質量測定、定量分析、交互作用 / 位置分析、以及追蹤蛋白質表現的變化趨勢等等。現在，就讓我們來深入探討蛋白質體學的應用，並介紹最新技術和研究趨勢：
(1) DISCOVER：發現新的蛋白質
若希望從茫茫的組織和細胞中發掘全新的蛋白質，質譜儀 (MS) 堪稱是最佳利器。MS 會透過強大電流、分子碰撞、或其他物理 / 化學方法將樣品離子化，並讓這些離子片段帶有正電或負電。接下來，這些帶電離子片段會被送入強大磁場打向質量分析器，而由於各個片段所帶的電荷相對於片段質量的比例 (荷質比, m/z) 會有所不同，因此各離子片段受到磁力的影響也會不同。如此一來，各個離子片段就會在磁場內循獨特的軌跡打到質量分析器上並產生電流，而透過這些電流的分析，質譜儀便可得知片段的質量，分子結構、片段數量、和樣品純度等參數，並可進一步和蛋白資料庫比對分析出感興趣的蛋白。當然，比對之後如果確定手上的樣本在資料庫完全沒有出現，MS亦可提供蛋白質化學和結構的相關資訊，協助研究人員一步步揭開新穎蛋白質的面紗。
質譜儀可精確辨識蛋白質的組成胺基酸，很適合用於發掘新蛋白質或解開未知蛋白質之間的交互作用。不過慢工出細活的道理自古不變，而質譜儀相對費心的前置作業和分析過程在分秒必爭的臨床和實務環境略有不足。蛋白質微陣列由數千種印在玻璃或特殊材質上的蛋白質所組成，能快速對特定樣品進行篩檢並得到結果。因此微陣列除可在第一時間偵測到血中病原而給急性感染者最準確的治療，更有潛力對各類癌細胞偵測標記蛋白和突變蛋白，讓癌症的診斷和治療更有效率。近期也出現了雷射微解剖-反向蛋白質微陣列的最新技術，利用雷射將顯微鏡上的組織樣本或生物切片進行解剖和切割，再置於微陣列載體上直接分解並萃出蛋白質以進行定性和定量分析。此方法相較於質譜儀更能迅速分析多種組織的蛋白質表現差異，因此除了可提供研究或診斷能參考的有效資訊，也可廣泛運用在發生學和動物發育的研究，從微觀角度探索發育過程中許多難解的秘辛。當然，微陣列也有其限制，像是蛋白質點印技術困難、價格偏貴、以及蛋白質體知識上的不足，但這些障礙應可隨生物技術的進展而獲得解決。不過蛋白質微陣列最根本的限制在於創新：也許微陣列可發掘蛋白質之間的重要交互作用，但是微陣列無法像質譜儀一樣發掘前所未知的蛋白質。即使透過微陣列發現會和已知蛋白質有交互作用的未知蛋白質，最後也得透過質譜儀方能驗明其身分。
(3) DIFFERENTIATE：大量辨識特定蛋白質
不過近年來，質譜儀也出現許多大量篩檢蛋白質的工具，例如最新的 iTRAQ (isobaric tags for relative and absolute quantitation) 技術，是利用穩定的同位素結合在蛋白質的 N 端和胺基側鏈，可同時將樣本中的各種蛋白質進行相對和絕對定量。iTRAQ 技術會先將欲分析的蛋白質樣本經過trypsin (一種蛋白酶，可將蛋白質切成小片段) 處理，再加入 iTRAQ 進行標記，接著進行液相層析串聯質譜儀 (LC-MS/MS) 分析。透過四種質量相同但報告基團 (reporter group) 不同的 iTRAQ 標籤，除了可依荷質比 (m/z) 直接比對資料庫而定出蛋白質片段，更能依各報告基團訊號的強弱進行相對或絕對定量。由於 iTRAQ 技術有靈敏度高、分析範圍廣、結果可靠、重複性高等特質，再加上能同時針對四個樣本定量數千種蛋白質的變化，故可有效應用於生物標記 (biomarker) 的開發，像是比較患者和正常人之間的蛋白質體表現差異而從中找出指標性的蛋白。如果想要了解藥物處理前的蛋白質體變化或是磷酸化蛋白體的變化，也可以用 iTRAQ 同時觀察數個樣本間數千種蛋白質的變化找出有興趣的目標，堪稱是蛋白質體學的一大利器。
(4) DEVELOP：開發全新蛋白質體學應用
蛋白質在體內合成後往往會進行各種修飾，例如醣基化、磷酸化、水解、形成雙硫鍵等等。質譜儀可精準地偵測和比較蛋白質的修飾狀態，目前甚至可以追蹤各種蛋白質醣基的形成過程，讓研究人員對蛋白質修飾和功能之間的關係得以更深入探討。
目前亟需這方面技術的研究領域就是代謝體學 (metabolomics)，主要著重在了解代謝過程中產生的這些小分子代謝物的性質，並由此取得宏觀資訊闡明生化反應途徑、代謝網絡及其交互作用、以及細胞、器官、乃至於個體的健康狀態。舉例來說，透過健康細胞和癌細胞代謝體的比較，研究人員即可發掘其中的代謝和訊息傳導差異，更可從中開發生物標記，用以診斷疾病或追蹤病程進展。另外，研究人員也可從健康和生病細胞 (或器官、個體) 的代謝體比較，找出致病機轉、改善途徑、以及藥物標的等豐富資訊，對於未來精準醫療和個人化治療有很大的發展潛力。隨著新世代定序技術和蛋白質體學技術的發展，代謝體的研究也逐漸朝基因表現和蛋白質修飾的方向發展，因為除了小分子代謝物之外，細胞、器官、或個體在特定時刻或接受某種刺激後當下的基因表現和蛋白質修飾情形，對了解生理運作和反應也非常重要。在這方面，質譜儀亦可發揮很大的功能，除了用以分析傳統代謝體學所探討的小分子代謝物之外，更能發掘新蛋白質、監控蛋白質的表現和修飾情形、並追蹤蛋白質之間的交互作用，有助於研究人員快速取得突破性的成果。
名詞解釋：代謝體 (metabolome) 泛指在特定時間下，一個胞器、一顆細胞、一種組織、一個器官、乃至一個生物個體所含有的所有小分子化合物。
蛋白質體學的醫療價值
2016 年 06 月 29 日，CPTAC 卵巢癌跨國研究團隊在著名的 Cell 期刊發表以蛋白質體學整合性技術分析卵巢癌細胞的研究結果。研究人員針對 174 個高度惡性腫瘤的基因體和蛋白質體分析結果進行比較，對於癌細胞的突變基因數目對蛋白質體的影響、最會促進基因突變的蛋白質、以及最能影響患者存活率的蛋白質均有重大發現和突破。在近未來，當更多類似研究運用在更多細胞和疾病上之後，相信蛋白質體學會成為臨床上不可或缺的診斷工具，不僅有助於即時掌握病情和治療效果，甚至可及早預測未來可能發生的問題並加以預防，讓人類對於自身健康也能擁有即時掌握能力。而在當今講求分享的年代，已有許多蛋白質體學工具和資料庫免費開放供研究人員使用，包括行之有年的瑞士 ExPASy 生物資訊入口網站：蛋白質專區 (http://www.expasy.org/tools/)、美國的西雅圖蛋白體中心 (http://tools.proteomecenter.org/software.php)、和專攻質譜儀工具的 ms-utils.org 網站 (http://www.ms-utils.org/wiki/pmwiki.php/Main/SoftwareList) 等等，資源非常豐富，只要有樣本和數據就不需煩惱後端分析。
基因體學、蛋白質體學、和 CRISPR 的整合應用實例
長庚大學的譚賢明教授在 2015 年透過基因體學、蛋白質體學、和 CRISPR 的整合研究，獲得 2015 年中央研究院年輕學者研究著作獎。譚教授發現發育過程不可或缺的 ADAR1 脫氨基酶會受到微 RNA (microRNA) miRNA-1/206 的負向調控，進而使 ADAR1 的表現量隨發育階段而有所改變。譚教授更發現 ADAR1 可修飾並抑制肌肉發育的相關基因所轉錄出之訊息 RNA (mRNA)，而當 ADAR1 在發育後期受到 miRNA-1/206 抑制後，這些肌肉發育相關基因的 mRNA 才得以移出核仁並轉譯出對應的蛋白質，以啟動肌肉細胞的分化。最近譚教授更利用次世代高通量定序譜出漢人轉錄體的 ADAR 脫氨基酶修飾位點，並將 RNA 的修飾與基因表現、蛋白質作用、以及 miRNA 功能進行結合，其闡明基因到蛋白質的各種調控機制和修飾作用之研究成果令人期待！
▍文章轉發：基因線上
