您不能不知的蛋白質定量技術 - iTRAQ技術背景與原理
大家都知道圖爾思蛋白質體技術服務是如何一次又一次的提供最優質的分析結果以及報告．其中蛋白質定量服務又是能夠讓客戶為他的研究找到很有潛力的蛋白質．大家知道蛋白質定量服務是利用什麼技術背景以及原理嗎？
不知道沒關係，今天就讓我們為您解答！
技術概念
圖爾思蛋白質體定量服務使用的技術是相對和絕對定量同位素標記 （isobaric tags for relative and absolute quantitation, iTRAQ）技術，是美國Applied Biosystems (ABI) 於2004年推出的一種全新的蛋白質定量分析技術。該同位素標記法與質譜儀技術相結合，能夠高通量地尋找不同蛋白質 的差異蛋白質並且準確進行相對或絕對定量，目前在蛋白質體學領域已得到了廣泛關注和應用。
技術產生背景
過去，科學家通常先進行SDS-PAGE，切斷條帶，再用質譜方法測量條帶中的蛋白質。可是，這種方法既不是非常敏感，也不是非常精確，對我們研究蛋白質有局限性。科學家們一直在探索蛋白質體學研究方法。現在，基於高度敏感性和精確性的LC-MS/MS方法，不需要凝膠，就可以獲得相對和絕對定量的蛋白質結果。常用的定量蛋白質體學的研究方法有DIGE（difference gel electrophoresis）、iCAT（Isotope-coded affinity tag）、SWATH（Sequential Windowed Acquisition of all Theoretical fragment ions）、SILAC(Stable Isotope Labeling with Amino Acids in Cell Cultures)和iTRAQ（isobaric tags for relative and absolute quantitation）。其中iTRAQ技術可實現對多種不同樣品中蛋白的比較，具有重現性好、靈敏度高、定性與定量可同時進行的優勢，已越來越多的被運用到蛋白質體學研究中。
iTRAQ試劑
iTRAQ實際上是一種同位素標記試劑，可與氨基酸連接的NH2標記同位素。
iTRAQ 包括三部分：報告基團（reporter group ），平衡基團（balance group），肽反應基團（peptide reactive group）。
- 報告基團（reporter group）質量分別為分子量差1的基團。
- 平衡基團（balance group）質量分別為分子量差1的基團，使得iTRAQ試劑報告基團和平衡分子的總分子量均為145Da，無論使用哪種iTRAQ試劑，不同同位素標記同一肽段後在一級質譜中，分子量完全相同，呈現的都是同一波峰值。
- 肽反應基團（peptide reactive group）是將reporter group與肽N端及Lysine側鏈連接，從而將報告基團和平衡基團標記到peptide上，幾乎可以標記樣本中所有蛋白質。
工作流程和原理
將標記好的4組胜肽段混合後，進行LC-MS/MS分析。由於4組樣品中相同蛋白質的同一條胜肽段被4種iTRAQ試劑分別標記後，其質量(M)仍然是一樣的(4種同位素標籤搭配不同平衡團後其總質量為相同)。所以在一級質譜上(MS1)，它們的m/z (mass-to-charge ratio)值是相同的(下圖”3”)。經過碎裂反應後產生的碎片離子（fragment ions），可透過資料庫的搜尋推出該胜肽段為哪個蛋白質。而胜肽段上釋放出來的4個報告基團標籤—114、115、116、117的強度即代表了4組樣品同一胜肽段的豐度（abundance）（下圖”4”）。
技術優勢
- 適用範圍廣：iTRAQ可檢測到胞漿蛋白、線粒體蛋白、膜蛋白和核蛋白等。
- 能對任何類型的蛋白質進行鑑定，包括高分子量，酸性，鹼性蛋白質。
- 高通量：一次最多可以實現8個樣品的定性定量分析。
- 結果可信高：基於高度敏感性和精確性的LC/MS/MS方法，完成相對和決定定量分析。
- 靈敏度高：對比SDS-PAGE可觀測到的蛋白變化在2倍以上，可檢測低豐度蛋白。
- 高效：定性定量同步進行，且有較高重複性。
應用
iTRAQ已被廣泛地應用於植物，微生物，動物，環境等多種樣本的蛋白質鑑定和定量，甚至應用到醫學研究領域，能夠分析鑑定出腫瘤組織的差異性蛋白質，從而找到candidate protein；也可以篩選出與藥物作用的差異性蛋白質，進而研究藥物作用target和機制； iTRAQ技術還可以為我們研究疾病的發生、進展機制，發現新的biomarker進而提供有力的技術平台。
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