【代謝體技術分享】多體學研究_非酒精型脂肪肝，微生物-鐵-肝脂肪軸
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這次多體學技術分享非酒精型脂肪肝(Non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD)，利用多個體學找出重要的生物標識(Biomarker)，並研究 Microbiome-Iron-Liver fat axis 三者間的關係。本篇研究採用n=807的人群樣本進行體學分析，更進一步利用in vitro細胞實驗和小鼠實驗來驗證與探討在人群樣本結果中所觀察到的現象[1]。
本篇多體學研究應用範圍
‧ 微生物總體基因體 (Shotgun metagenomics)
‧ 微生物16S定序 (16S rRNA sequencing)
‧ 轉錄體 (Transcriptomics)
‧ 代謝體 (Metabolomics)
非酒精型脂肪肝 (NAFLD)
NAFLD是一種常見的代謝疾病，這類慢性肝炎在全球的盛行率逐漸增長，若該疾病持續進展，可能導致肝硬化(Cirrhosis)和肝細胞癌(Hepatocellular carcinoma)的疾病發生，更有風險造成二型糖尿病與心血管疾病的發展。
造成NAFLD發展的因素複雜包括肥胖、代謝異常、高脂飲食等，且參與在其中的代謝路徑包括：糖、脂質、氨基酸、鐵和膽酸[2]。
探討Microbiome-Iron-Liver fat 的原因
從上述簡單的介紹得知，造成NAFLD的因素其實很多也很複雜，為何本篇選擇看腸道菌、鐵和肝臟脂肪呢？
文中解釋到，在先前文獻中觀察到腸道菌與宿主肝脂肪堆積有關。在另一篇研究發現腸道菌可能會影響宿主對與飲食中鐵的吸收，並且與NAFLD的發展有關。
已知 鐵 和 腸道菌 各別對NAFLD有影響，但尚不了解這兩者間的交互關係，因此本篇研究目的鎖定研究患有NAFLD肥胖患者中，其鐵與腸道菌之間的關聯性。
你需要先知道的鐵蛋白(Ferritin)
在進入實驗解說之前，你需要先了解什麼是Ferritin (鐵蛋白)。在後續的實驗結果都會以 血清內Ferritin的濃度 作為鐵在宿主內的平衡狀態，在臨床上NAFLD患者血清內Ferritin濃度都會較高，可作為判斷疾病的生物標識之一。
所以說，Ferritin到底是什麼呢？ Ferritin主要儲存鐵離子於肝臟、腦等器官內，若過量攝取鐵可能造成肝臟氧化壓力(Hepatic oxidative stress)、發炎等肝臟損傷症狀。若過量的Ferritin儲存在肝臟，會造成血清內Ferritin濃度增加。[2]
血清ferritin、肝臟脂肪累積、腸道菌群組成與功能，三者關係
由上方的介紹我們已知血清ferritin、腸道菌組成、肝臟脂肪累積，這三者間在文獻中有關聯，本篇收集到807個人群樣本，再一次檢視這三者間的關係，更進一步利用shotgun metagenomics檢測腸道菌群的功能。
本篇將807個人群分成3大隊列(Cohort)：Discovery, Replication和Independent，如圖一，Discovery和Replication cohort為肥胖的NAFLD患者，Independent為與NAFLD疾病不相關的肥胖或非肥胖人群。圖一紅框的部分表示在這個段落所使用到的樣本與體學。
圖ㄧ、實驗設計圖與本段落使用樣本與組別。
(1) 肝臟脂肪累積程度越高，血清Ferritin濃度越高
從圖二a、b可見不論在Discovery或Replication cohort，肝臟脂肪累積程度越高，血清Ferritin濃度也有越高的趨勢。將Ferritin濃度的表現分為四分位數(Q1-Q4)，四分位數較高的病患(Q3&Q4)，其微生物基因的豐富度顯著低於Q1和Q2 (圖二d)。
圖二、血清Ferritin、肝脂肪累積與微生物基因豐度的關係。
(2) 血清Ferritin與特定腸道菌菌群有顯著關聯
結果中發現菌門Firmicutes, Actinobacteria 和 Proteobacteria豐度的顯著下降與ferritin濃度有顯著關聯。圖三e、f分別為血清Ferritin與菌科與菌屬的關係，圖中x軸正負表示Ferritin濃度與該菌呈現正相關或負相關，舉例：在圖三e，最底下的三群菌科Pasteurellaceae, Leuconostocaceae和Micrococcacea與血清ferritin有顯著負相關。
那在非NAFLD患者但有肥胖症狀的Independent cohort是否也可以看到類似的狀況呢？
圖三、血清ferritin微生物菌相和菌群基因功能。
(3) Independent cohort微生物基因功能與血清ferritin的關係
在Independent cohort 樣本數130的結果中(圖三g)，與在前述2個cohort中發現一致的結果，包含：(a) 與ferritin濃度負相關的菌種Veillonella, Bifidobacterium和 Lactobacillus (隸屬於菌門Firmicutes和Actinobacteria)。 (b) 與ferritin濃度正相關的菌種Bacteroides和Prevotella (隸屬於菌門Bacteroidetes)。
Shotgun metagenomics的結果中，篩選出有顯著差異的菌種功能基因(圖四h)，發現有顯著差異的基因與下列這些功能有關：
(a) Iron and amino acids transport
(b) Glutathione metabolism
(c) Heme and siderophore biosynthesis
(d) Fatty acid biosynthesis
(e) DNA replication and repair
＊本段重點：在人群實驗結果中，NAFLD肥胖患者的血清Ferritin濃度與肝脂肪累積和特定腸道微生物有顯著關聯，甚至在非NAFLD的人群可見腸道菌群與鐵、胺基酸、糖相關的代謝基因有顯著變化。
肝臟轉錄體、特定腸道菌與肝臟脂肪累積的關係
了解腸道菌群與鐵相關的代謝基因有變化，那在肝臟中，與鐵代謝相關的基因表現量是否也有變化？ 本段實驗設計所使用的樣本與組別請參考圖四。
圖四、本段實驗使用的實驗組別。
(1) 人群實驗：肝臟轉錄體與微生物總體基因體
在肝臟轉錄體的結果中，可見血清Ferritin有關的基因大多參與在Iron與Glucose的代謝路徑且有顯著關聯 (圖五b、c)。與鐵、胺基酸有關的膜轉運蛋白(Solute carrier transporters, SLCs) 基因表現也有顯著關聯 (圖五e，紅箭頭表示與Ferritin關聯性強的基因)。在熱圖結果可以清楚看見與Ferritin正負相關的基因，圖五h中，基因名用粉底與綠底標示的分別與Ferritin呈正相關與負相關，圖上顯示粗體的基因是與肝脂肪累積有關的基因。
將轉錄體與微生物總基因體的結果整合，圖五g、k顯示出這些在上一個段落找到的關聯菌科與宿主肝臟基因表現的相關性。
(2) 細胞實驗驗證
為了驗證在人體發現的結果，作者進行in vitro的實驗，使用Human primary hepatocytes進行驗證。利用鐵和(Palmitic acid, PA)誘發肝細胞脂肪累積機制，檢測圖五h中列出的基因表現 (圖五l-s)，可見與Ferritin負相關的肝脂肪累積基因下調(GY2, SEC24B, MTUS1, SOCS2, SLC51A)。而與Ferritin正相關的基因(PDE7A)表現量上調，此基因與肝脂肪變性有關。
圖五、肝臟轉錄體與Ferritin的關係。
＊本段重點：不論在人群或是細胞實驗，皆可看到與鐵、胺基酸和肝脂肪累積相關的基因和血清Ferritin有關，並結合在第一段實驗所找到的特定菌種交錯分析。
宿主血漿和尿液代謝物與腸道菌與肝臟轉錄體
在肝臟轉錄體結果中，已知有變化的基因大多參與在鐵、糖、胺基酸等代謝路徑，基因的變化是否反映在下游代謝物的變化呢？ 實驗檢測Discovery和Replication cohort的血漿與尿液代謝物，並結合轉錄體和總體基因體的結果 (圖六)。
圖六、本段實驗使用的實驗組別。
在血漿與尿液的檢測結果，大多與Ferritin有關聯的代謝物大多為Ketone bodies 和 Gluconeogenic substrates (圖七a-f)，並結合轉錄體的結果繪製Heatmap (圖六i、j)。將這些與Ferritin有關的代謝物和微生物進行分析 (圖七i-l)，可見與Ferritin負相關的菌科與Histidine, Tyrosine, Citrulline 和 Glutamine呈正相關，而與Ketone bodies (3-OHB和Acetoacetate)呈負相關。
圖七、代謝體與Ferritin。
＊本段總結：結合前兩段所找到與Ferritin有關的肝臟轉錄體基因和腸道微生物，加入代謝體的研究結果，驗證基因下游代謝物在與鐵、肝脂肪累積等NAFLD患者常見代謝異常狀況相符。
鐵與腸道菌的關係
本篇最主要探討的問題，了解NAFLD患者的鐵與腸道菌之間的關係，在前面幾個段落，已知人群實驗與細胞中，確實看到不論在基因或代謝物的表現，Ferritin濃度與特定腸道菌和鐵、胺基酸、糖等基因或代謝物有關。作者更近一步利用小鼠實驗驗證鐵與腸道菌(16S rRNA)的關係，設計3種實驗：
(a) Study 1：餵食小鼠不同濃度的鐵，看菌相變化
(b) Study 2：餵食小鼠含不同濃度的高脂(HFD)或非高脂(No-HFD)飲食
(c) Study 3：糞菌移植，將高或低濃度血清Ferritin的人糞便移植到小鼠，看Ferritin的濃度與小鼠肝臟基因的表現
(1) 鐵與高脂飲食對腸道菌的影響
不同濃度的鐵劑量在結果中呈現不同的菌相組成 (圖八a-b)。而在高脂飲食下(低鐵劑量)，顯著影響降低小鼠腸道菌相的多樣性，但在高鐵劑量下，高低脂飲食的狀況與上述相反(圖八d-g)。圖八h-m顯示高脂與非高脂飲食組的菌群組成分佈PCA結果(圖八h、i)，並列出與鐵濃度有關的顯著關係菌科(圖八l)與菌屬(圖八m)。
圖八、Study1和Study2的實驗結果，鐵和高脂飲食對腸道菌的影響。
(2) 糞菌移植結果
取高與低血清Ferritin的人類糞便移植至用抗生素處理的小鼠內，對小鼠肝臟基因進行檢測，結果顯示，來自高濃度Ferritin糞便移植的小鼠組別，與鐵相關的基因有上調 (ftl1, fth1, slc40a1)和下調 (tfrc)的變動 (圖九)。
圖九、Study3糞菌移植結果。
＊本段總結：作者透過小鼠實驗驗證鐵的濃度會影響腸道菌的組成，並透過糞菌移植驗證Ferritin濃度與鐵相關的代謝基因有關聯。作者提到，在不同鐵濃度下高低脂飲食所造成腸道菌群多樣性的差異待需更多實驗佐證。
總結
本篇實驗結果在人群、細胞、小鼠實驗，透過多體學的方式驗證在NAFLD肥胖患者中，鐵含量會影響肝臟脂肪累積也會影響腸道菌的組成，並且特定腸道菌的鐵相關基因功能也有顯著上下調的狀況。此篇研究重要發現 Microbiome-Iron-Liver fat axis，可作為未來發展治療目標的參考依據。
參考文獻
[1] Mayneris-Perxachs, J., Cardellini, M., Hoyles, L., Latorre, J., Davato, F., Moreno-Navarrete, J. M., ... & Fernández-Real, J. M. (2021). Iron status influences non-alcoholic fatty liver disease in obesity through the gut microbiome. Microbiome, 9(1), 1-18.
[2] Shao, M., Ye, Z., Qin, Y., & Wu, T. (2020). Abnormal metabolic processes involved in the pathogenesis of non‑alcoholic fatty liver disease. Experimental and Therapeutic Medicine, 20(5), 1-1.
