【代謝體技術分享】多體學研究_代謝體與微生物體

近期研究指出美國有3200萬的人口飽受食物過敏之苦，已成為現今工業社會疾病，並且與非傳染性疾病(non-communicable diseases, NCDs)相同，都有增加的趨勢，非傳染性疾病包括：氣喘、肥胖、糖尿病等。
治療食物過敏的方法基本上是透過持續提供適量劑量的食物過敏原，來降低對過敏原的敏感度。文章中提到的治療法為口服免疫治療(Oral immunotherapy, OIT)，OIT的治療方法通常需要好幾年的時間，在治療期間容易出現腸道疾病，也被觀察到有高的放棄率。

有沒有更安全、更有效率的治療方法呢？

食物過敏與腸道菌有關？

在說明更有效的食物過敏治療方法前，我們先來看看食物過敏是否真的與腸道菌有關？以下列出同一個團隊發表的文獻和結果短述。

• Ref.17 在小鼠模式發現，Clostridia class 可以保護小鼠對於花生過敏原的敏感度。
• Ref.18 將有牛乳過敏的嬰兒糞便移植至無菌小鼠，無菌數會出現對牛乳過敏反應，反之移植健康的嬰兒糞便，則小鼠對於牛奶過敏免有抵抗力。
• Ref.28 提供對牛乳過敏的嬰兒含特定菌株的配方奶，可改善嬰兒的過敏症狀並且其腸道菌群組成有所變化。

除了上述的幾篇文獻，還有其他團隊發現在健康和過敏兒童的糞便菌相組成是有差異。
既然已知微生物與食物過敏有關，那微生物是怎麼調控食物過敏的呢？其實在同一團隊的研究結果發現(ref.17)，在小鼠實驗中，若要讓小鼠對過敏原產生保護力，需同時誘導 (1) 本身腸道細胞對過敏原的免疫調解反應，和 (2) 腸道內共生菌誘發的腸道屏障保護反應，且該保護反應與Cytokine IL-22有關。

既然已知腸道菌有機會成為食物過敏的療法之一，除了觀察上述小鼠實驗的結果，作者更近一步觀察在基因體相同的雙胞胎，一位健康、一位食物過敏，其腸道菌是否有差異呢？

作者首先篩選符合觀察條件的雙胞胎，流程如下圖一，接下來兔編會依據這個流程告訴大家，雙胞胎的食物過敏與 (1) 腸道菌、(2) 代謝物 和 (3) 前兩者關聯分析，的研究結果。

圖ㄧ、研究設計流程圖。

實驗最終篩選到18對雙胞胎，其中13對(Allergy-discordant)為其中一位有過敏、另一位健康，另外5對為(Allergy-discordant)兩者皆有食物過敏。這18對雙胞胎包含同卵、異卵，在19歲前都生活在相同的環境，年紀從0.5-70歲都有。


食物過敏與腸道菌
採取這18對雙胞胎的糞便檢體進行16S rRNA gene sequencing (V4 region)，但其中一對(Allergy-discordant)的雙胞胎被排除，因其中一位定序深度不夠。最終結果僅看17對雙胞胎的結果，初步檢視菌項組成，並計算同卵/異卵相關性、同一對雙胞胎過敏/健康的相關性、alpha diversity和beta diversity，都沒有發現顯著的差異存在(圖二)。


圖二、菌相分析結果(Family level)。

作者近一步找到出在有過敏與健康的雙胞胎找出有表現量差異的64 OTUs (圖三)，其中62 OUTs在健康的個體中豐富度較高，另外2 OTUs在過敏個體豐富度較高。在下圖中標示粉紅字的為分屬於 Clostridia class (Lachnospiraceae, Ruminococcaceae, unclassified Clostridiales)。


圖三、健康與過敏雙胞胎的糞便菌相組成。


更近一步作者比對雙胞胎內的差異菌種表現，可以看見圖四，在Discordant twins中健康與過敏雙胞胎的菌相相對表現量有差異，圖中圓圈大小代表OUT的相對表現量多寡。在圖五，統計了這17對健康與過敏雙胞胎的OUT abundance score，結果顯示有顯著差異。


圖四、健康與過敏雙胞胎的菌相相對表現(圓點呈現方法)。


圖五、OUT abundance score在健康與過敏者的差異。


以上結果與作者的假設相符，即使是基因相同的雙胞胎，其糞便菌相組成過敏與健康的手足間也有所差異。


食物過敏與代謝物
是否對於忽然出現探討代謝物有些不知所措？雖然本次主題是多體學，但為什麼是挑選代謝體學？其實腸道內的微生物會產生許多代謝物，這些代謝物有的會參與生物的免疫反應並影響人體的健康，比如先前提過的微生物代謝物-短酸。

在18對雙胞胎的糞便檢體中，利用LC-MS/MS進行非標靶(Untargted)代謝體分析，並找到97個在健康與過敏者間有表現量差異的代謝物，其中33個在健康者的表現量較高(圖六A)，另外64個在過敏者的表現量較高(圖六B)。


圖六、健康與過敏者的差異代謝物表現量。


為了更近一步了解這97個差異代謝物參與哪些代謝路徑，結果如圖七A，圖中箭頭所指的兩個Pathway分別在健康(DAG pathway)與過敏(Food component/plant pathway)者有顯著的豐富度。針對上述提到的兩個Pathway，作者還發現在DAG pathway內的代謝物Comp ID:54963 (圖七B)和在Food component/plant pathway中發現的代謝物Comp ID:38105 (圖七C)，這兩個代謝物的差異表現趨勢不論在所有類型的雙胞胎或是單看Discordant pairs都是相同的。


圖七、健康與過敏者差異代謝物路徑分析。


食物過敏與腸道菌與代謝物
在前面兩個主題分別探討了食物過敏與腸道菌和代謝物的關係，那究竟這些菌跟哪些代謝物表現是有關聯的？ 單然有關聯是單指在表現量上時相同趨勢(正相關)或是相反趨勢(負相關)，不代表該菌就一定會產生該代謝物，這點在數據解讀上面一定要注意。

作者將有差異表現的64 OTUs和97個差異代謝物進行關聯分析(Spearman’s correlation)，發現其中21個OTUs為Healthy-abundance，1個OTU為Allergic-abundance結果如圖八。圖中y軸代謝物的部分，作者依聚類(Clustering)的結果將代謝物分成Group1-5，並在圖九A中分析各Group內的代謝物隸屬於哪些pathway (Super pathway 和sub pathway)。

在圖八的x軸OUTs的部分，粗體的表示在Species annotation的結果中，該菌基因序列比對結果相似度>99%者。作者進一步檢視其中兩個OTUs (OTU556835和OTU188079)在16S的結果和qPCR的結果是否相符(圖九B-E)，這兩株菌皆在健康的雙胞胎表現量較高。

OTU556835註釋結果為Phascolarctobacterium faecium (Family Acidaminococcaceae)，該菌已知會將Succinate代謝為短鏈脂肪酸(Short chain fatty acids, SCFAs)，順帶一提，作者其實有用GC-MS檢測糞便中的SCFAs含量，但在13對Discordant twins內沒有顯著差異。有趣的是，還記得前面有提到在小鼠實驗中若要對食物過敏原產生需要符合兩個條件，其中一個是藉由共生菌群誘發的腸道屏障保護反應，且和IL-22有關，那這件事情和P. faecium有什麼關係呢？在文章中的Ref.35的研究成果提到，在缺乏Succinate的狀況下，P. faecium能藉由IL-22–mediated glycosylation保護腸道免於Clostridium difficile的感染。

OTU188079註釋結果為Ruminococcus bromii (Family Ruminococcaceae)，在先前研究中已知R. bromii與消化纖維產生SCFAs有關，同樣有趣的是在Ref.34的研究中顯示若在生命早期(3-12月) R. bromii消減與遺傳過敏症與丁酸產生減少有關。

上述兩隻菌在先前中都沒有研究直接指出與過敏有關


圖八、差異代謝物和OTUs關聯分析。


圖九、關聯分析聚類通路與菌種分析。


總結
(1) 菌種：64 OTUs中，在健康雙胞胎豐富度較高的菌種大多隸屬於Clostridia class，進一步在Species 註解的結果中找到兩株在關聯分析中顯著關聯較高的菌種Phascolarctobacterium faecium 和 Ruminococcus bromii，這兩株菌在未來有機會成為食物過敏治療的療法之一。
(2) 代謝物：DAG通路類的代謝物在健康雙胞胎內的豐度較高，且先前研究指出Clostridia class可以產生DAG。DAG有潛力作為檢測健康糞便的Biomarker，未來研究需更加了解DAG在對抗過敏反應中所扮演的角色。

參考文獻
Bao, R., Hesser, L. A., He, Z., Zhou, X., Nadeau, K. C., & Nagler, C. R. (2021). Fecal microbiome and metabolome differ in healthy and food-allergic twins. Journal of Clinical Investigation, 131(2), e141935.