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進行微生物群落研究時，往往會需要檢測菌相與不同環境變量(因子)間的相關性，例如：
1. 微生物群落與生態環境變量間的相關性
2. 人體微生物與疾病病程發展的相關性
3. 不同藥物處理後，微生物組成與病情改善間的相關性
因此需要透過特定的環境因子關聯模型，分析特定因子或因子組合對細菌物種的影響程度。今天我們就來聊聊有哪些分析方法可以進行環境因子影響評估吧！
環境因子分析 - 限制性排序分析
限制性排序分析（Constrained Ordination）是基於對應分析發展的一種排序方法，將對應分析與多元回歸分析結合，每一步計算均與環境因子進行回歸，又稱多元直接梯度分析（Multivariate Direct Gradient Analysis）。主要用來反映物種與環境因子間的關係，可檢測環境因子、樣品、菌相兩兩間的關係，找出影響樣品分布的重要環境驅動因子。
1. RDA/CCA分析
常見使用的分析方法有 RDA（Redundancy Analysis, 冗餘分析）與 CCA（Canonical Correspondence Analysis, 典範對應分析）[1, 2]。而 RDA 是基於線性模型（linear），CCA 是基於單峰模型（unimodal）。一般根據 DCA（Detrended correspondence analysis）分析梯度值確定適合採用線性或單峰模型[3]。DCA 分析結果中以 Gradient Length 第一軸的大小來判斷：
· > 4 採用單峰模型
· 3-4 可能選用單峰模型
· 2-3 可能選用線性模型
· <2 採用線性模型
並藉由統計 Envfit 環境因子表，顯示各環境因子對排序結果的相關性係數及顯著性檢驗數值。
圖一. 組間環境因子與物種關聯 CCA 分析圖
圖二. 組間環境因子與物種關聯 RDA 分析圖
說明：圖中箭頭長度顯示環境因子對細菌物種影響程度，以正紅色代表為統計上具有顯著性影響的環境因子。箭頭間夾角可代表環境因子之間的相關性，銳角為正相關；鈍角為負相關。
2. db-RDA 分析
dbRDA (distance-based redundancy analysis) 為基於 RDA 開發的分析方法，與 RDA 同屬於線性模型。RDA 為採用歐氏距離 (Euclidean distance)，然而歐式距離會受限於某些資料型態，db-RDA 能解決此限制，可採用 Bray-Curtis 或其他方法進行分析[4]。db-RDA 分析過程主要分成三個步驟：
(1) 依據選用的演算法計算距離矩陣
(2) 進行 PCoA 計算
(3) 利用 PCoA 獲得的特徵值與環境變數進行 RDA 分析
圖三. 組間環境因子與物種關聯 db-RDA 分析圖
環境因子分析 - Mantel Test 分析
1967 年 Nathan Mantel 進行流行病學研究時首次提出，用以檢驗兩個不同總體之間的相關性[5]。Mantel test 在微生物研究上有著廣泛的應用，普通的相關分析只能檢驗單一環境因子與單一微生物類群（例如某一個屬）間的關係，而基於距離矩陣的 Mantel test 可檢驗單一或一組環境因子與整個微生物群落的相關性。並且不管什麼樣的資料，只要能計算有距離屬性的值，都可轉為距離矩陣進行分析[6, 7]。
分析使用微生物群落 Bray-Curtis 距離矩陣，並將環境變數（如pH、溫度、地理、鹽度等）進行歐式距離（Euclidean distance）計算作為另一個距離矩陣，採用 Spearman correlation 檢驗兩個矩陣之間的相關性。Permutations 置換次數設為 9,999 次。
表一. Mantel Test分析統計結果
說明： r反映微生物群落與環境因子間相關性，絕對數值越大則越相關；P值小於 0.05 表示具顯著性相關
此外，還可進行 Partial Mantel test 分析，將某些環境因子作為控制矩陣，計算微生物群落矩陣與剩餘目標環境因子矩陣的相關性。即可以排除環境因子之間自相關的干擾[8]。例如，採樣的地理距離可視為一組環境因子，水質中各種理化數據可以看成另一組環境因子。partial Mantel test 能屏蔽水質理化參數的影響，單獨檢驗地理距離與整個微生物群落的相關性。
環境因子分析 - BioENV 分析
當研究者擁有數量較多的環境因子變數時，BioENV 可以提供生物-環境連結的分析[9]。主要是透過逐步分析和相關檢驗，根據提供的環境因子變數計算並統計出與群落(OTU)相關性最高的環境因子組合，後續可依據挑選出的環境因子組合進行分析[10, 11]。然而，藉由 BioENV 分析挑選出其一環境因子組合也存在著風險，因為如果當不同組合計算出的數值相近時，挑選了數值相對高的組合有可能漏掉部分關鍵的環境因子。可進一步地結合 Mantel test 分析，檢驗 BioENV 挑選出的每一環境因子組合與整個微生物群落的相關性。
圖四. BioENV分析示意圖說明：計算物種群落間的距離矩陣，使用Bray-Curtis距離；計算環境因子的距離矩陣，使用Euclidean距離，並採用Spearman's rank correlation coefficient 計算相關性。
說明：Rank 依據計算出的 rho 統計量由大到小排序；rho 統計量反映微生物群落與環境因子組合間相關性，絕對數值越大則相關性越強。P 值為 Mantel test 分析的檢定結果。
參考文獻
[1] Xu, J., et al., Structural modulation of gut microbiota during alleviation of type 2 diabetes with a Chinese herbal formula. ISME J, 2015. 9(3): p. 552-62.
[2] Tripathi, B.M., et al., The impact of tropical forest logging and oil palm agriculture on the soil microbiome. Mol Ecol, 2016. 25(10): p. 2244-57.
[3] GauchJr., M.O.H.G., Detrended correspondence analysis: An improved ordination technique. Vegetatio, 1980. 42(1-3): p. 47-58.
[4] Distance-based redundancy analysis: testing multispecies responses in multifactorial ecological experiments. Ecological Monographs, 1999. 69: p. 1-24.
[5] Mantel, N., The detection of disease clustering and a generalized regression approach. Cancer Res, 1967. 27(2): p. 209-20.
[6] Smith, C.C., et al., Dietary input of microbes and host genetic variation shape among-population differences in stickleback gut microbiota. ISME J, 2015. 9(11): p. 2515-26.
[7] Rui, J., et al., Responses of Bacterial Communities to Simulated Climate Changes in Alpine Meadow Soil of the Qinghai-Tibet Plateau. Appl Environ Microbiol, 2015. 81(17): p. 6070-7.
[8] Sunagawa, S., et al., Ocean plankton. Structure and function of the global ocean microbiome. Science, 2015. 348(6237): p. 1261359.
[9] Clarke, K.R.A., M, A method of linking multivariate community structure to environmental variables. Marine Ecology Progress Series, 1993. 92(3): p. 205-219.
[10] Brooks, A.W., et al., Gut microbiota diversity across ethnicities in the United States. PLoS Biol, 2018. 16(12): p. e2006842. [11] Mahnert, A., et al., Man-made microbial resistances in built environments. Nat Commun, 2019. 10(1): p. 968.
圖爾思生物科技 / 微生物體研究中心
郭育倫 文案
