你的抗體專一嗎? 抗體「忠誠度」大考驗! 最受認可的抗體驗證方法大公開!
在科學研究中，抗體被廣泛用於檢測蛋白質的表達和定位，然而，抗體的專一性和可靠性一直是科學家困擾的問題。根據 2012 年發表在《Nature》的文章中，發現竟有多達 89% 的重點實驗結果無法被重現，這顯示了在科學研究中有非常嚴重的「重複危機」。
除此之外，進一步的研究表明，許多抗體在文獻中缺乏充分的專一性驗證。例如，在一項針對表觀遺傳學研究中的 246 種抗體的調查中，竟有1/4的抗體不具有專一性，而在一篇近期發表的神經科學研究中，測試了 65 種神經科學相關抗體，超過一半的抗體未能通過至少一次的驗證測試。這些數據其實都表明了目前許多市售抗體對於目標蛋白是不專一的，就像情人之間，你的男朋友/女朋友跟你在一起的時候他卻還會跟別人約會一樣，這樣的情況就容易導致實驗結果不可重複，甚至導致整個研究領域的錯誤方向，因此抗體”忠誠度大考驗”(抗體驗證)就非常重要了。
有鑑於此，2016年，國際抗體驗證工作小組在《Nature Method》提出的「五大抗體驗證策略」，除此之外，還有其他方法也可以你的抗體是否專一，本篇帶大家了解有那些抗體驗證的方法吧。
抗體驗證的五大策略
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基因驗證法 (Genetic Strategies)
透過Knockout(KO) 或Knockdown(KD)技術，減少或完全去除目標蛋白作為因性對照。
預期抗體信號會消失或是減弱，則表示抗體具備專一性。
優點：
這是目前認為最可靠也最多科學家認可的驗證方式，且許多市售KO細胞可以購買方便檢測。
缺點：
去除某對於某些關鍵基因（如維持細胞存活的基因）可能導致細胞死亡，無法繼續測試。
某一細胞株中的結果不一定能應用於所有細胞或組織。
複項驗證法 (Orthogonal Strategies)
同時使用抗體相關和抗體無關的方法來確認抗體的專一性。例如，同時進行蛋白組學或轉錄組學數據與抗體檢測到的目標蛋白表達進行比較。如果結果一致，則表示抗體具備專一性。
優點：
當無法使用基因驗證時可以使用，且多組學數據容易取得，可以整合不同數據，增加可性度。
缺點：
當 RNA 和蛋白質的表達不一致時，數據會不好解釋。
獨立抗體驗證法 (Independent Antibody Strategies)
使用針對同一蛋白但不同表位的抗體對目標蛋白進行檢測，然後比較結果。如不同抗體的結果相符，則表示抗體具備專一性。
優點：
通過使用多個抗體進行比較，可以提供多重保證。
缺點：
當多個抗體都表現出非專一性染色時，會誤導結果
要同時找到多個且辨識不同表位的抗體較不容易。
標記蛋白驗證法 (Expression of Tagged Proteins Strategy)
將目標蛋白以有標記和無標記的方式比達，再使用Anti-tag以及Anti-target的抗體進行驗證，若兩者表達量呈正相關，則表示抗體具備專一性。也可以使用重組技術來表達過量的目標蛋白。
優點：
可以確認抗體能特異性識別標記蛋白，且對相關家族蛋白不會辨識。
缺點：
過表達的重組蛋白可能無法代表內源性表達水平，難以確保抗體在低表達情況下仍然專一。
質譜法（IP-MS）
利用抗體免疫沉澱(IP)沉澱目標蛋白，接著進行質譜分析以確定抗體所結合的蛋白質。
優點：
可以精確顯示抗體所結合的蛋白質，並提供專一性證據。
缺點：
- 蛋白交互作用會使得IP沉澱出不相關的蛋白，而影響結果判斷。
- 並非所有蛋白接能透過抗體沉澱。
其他抗體驗證方法
生物模型驗證法 (biological strategies )
使用疾病模型或生物系統，檢查抗體對目標蛋白表達或定位的專一性。例如，在疾病狀態下增加或減少蛋白質表達，並與抗體結果進行比較。
優點：能夠反映出真實生物條件下的抗體表現。
缺點：適合的生物模型可能難以找到，或是某些蛋白缺乏公開數據。
細胞處理驗證法 (Cell Treatment Strategies)
此為細胞生物學最常使用的方法，處理細胞改變蛋白質的修飾或定位，例如使用細胞因子誘導蛋白質磷酸化，然後與對照組比較。
優點：提供抗體在不同細胞狀況下的專一性驗證。
缺點：需要有效的技術來操作目標蛋白，並非所有蛋白都適用。
驗證方法中，基因驗證法可性度最高
抗體驗證是確保科學研究結果準確、可重複的關鍵步驟。歷史上，由於缺乏充分的驗證，許多研究結果被質疑甚至無法重複。
通過使用多種抗體驗證方法，我們可以減少這些錯誤的風險，進而提升研究的可信度，加快科學發展的步伐。
而在眾多的驗證方法中，基因驗證法 (Genetic Strategies)是可性度最高且最多人認可的方式，
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