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2021．11
【三代定序於人類癌症的應用】
原創文章 引用請註明出處
先前的文章中有跟大家介紹基因變異依照型態和鹼基對長度可分為多類，而三代定序在大於 50 個鹼基對的結構變異偵測上有顯著較好的結果，關於不同變異平台之間比較可參考這篇：基因變異那麼多，到底要用哪個平台定序？
結構變異在臨床上佔有重要角色，影響範圍包含孟德爾遺傳疾病、神經及精神疾病、癌症等[1]。癌症基因體多變且不穩定，當結構變異發生時，容易影響抑癌與致癌基因的功能，進而影響癌症進展或臨床上對藥物的反應。然而，三代定序在癌症領域的應用算是較其他領域成熟。這篇文章主要整理了一篇回顧文獻[2]，分享三代定序在人類癌症結構變異分析中的應用。
1. 建立一日檢測流程找出癌症結構變異的斷點[3]
利用分子檢測分類癌症種類已成為臨床上常規檢測之一，用來協助診斷、預後和治療決策。像是中樞神經系統腫瘤，目前世界衛生組織的分類明確要求進行分子檢測，如 1p/19q 缺失或 IDH 突變，以進行綜合的決策判定。目前臨床上需要多重技術來評估不同基因體和表觀基因體的改變，所需時間落於數週內，使得標準化和普及實施更加困難，無法即時做決策。這篇文獻目的以攜帶便利的 Nanopore MinION 為主，驗證臨床上可能會遇到的基因變異情況。定序策略使用低深度定序來偵測基因拷貝數目變異（copy number variants）及甲基化，而較精細部分像是單核苷酸變異（single-nucleotide variants）則使用擴增子方式進行深度定序。Nanopore MinION 能在6小時內完成 0.1X 深度的定序，搭配其他生資流程，能有效的依照癌症泛基因體做分類，區分不同原發部位的膠質瘤、髓母細胞瘤和腦轉移瘤。單核苷酸變異分析則研究了 IDH1、IDH2、H3F3A 等基因，可在2-20分鐘內產生1000X的定序深度，甚至是 GC 比例高的 TP53 或TERT 啟動子區域，也可運用此流程檢測其基因變異（圖一）。此篇文獻提供的檢測策略相較於過去的雜合式策略與現今技術，能夠更快速的為每位癌症患者提供精準醫療，也適合運用於資源有限的環境中。
【圖一】
2. 偵測轉座子導致的結構變異
轉座子（transposon）能夠在基因體中透過轉錄或反轉錄的方式，加上內切酶的作用後，出現在其他基因座上，而這種「跳來跳去」的方式有時會造成基因體上的結構變異。癌症泛基因體計畫（The Pan-Cancer Analysis of Whole Genomes, PCAWG）為了研究體細胞內轉座子在致癌過程中扮演的角色，研究了 38 種癌症、 2,954 個癌症基因體的體細胞逆轉錄（somatic retrotransposition）作用機制[4]。共找出 19,166 個逆轉錄點，其中有35%會造成影響。然而，轉座子像是LINE-1最多可造成 6 kb 的插入序列，用長讀長定序使得檢測上更準確。在一篇2020年預印本文獻中，發布了一個偵測工具稱為『nanomonsv』[5]。Nanomonsv可用來檢測癌症與其相對應正常組織中移動元素插入造成的結構變異，利用對應到參考序列的方式，找到假設的結構變異與可支持其變異的定序片段，而結構變異的斷點則由one-time jump Smith–Waterman演算法來辨識。最後，假設的結構變異再經由重新對應至參考文獻中的結構變異序列、和正常組織間的比較等方式做確認（圖二）。利用這套流程即可研究所有癌細胞中的LINE-1插入異常。
【圖二】
3. 單倍體定相與結構變異
在癌症基因體中，定相技術可用來檢測等位基因上的單核苷酸或結構變異。最後一篇文獻與講述肺腺癌中常見變異：表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor, EGFR）外顯子 19 缺失[6]。作者利用 PacBio CCS 模式定序兩個肺癌病人檢體共四個單倍體，並且以WhatsHap做單倍體定相。定序 EGFR 及其附近正負 500 kb 的距離，發現一非編碼區域與非小細胞肺癌常見EGFR突變區域有著超過 90% 的相似度，後續利用其他方式驗證了此非編碼區與 EGFR 基因之間的交互作用會影響其基因活性進而變成腫瘤主導基因（cancer-driver gene）。除此之外，此項研究還找到了之前未於人類基因參考資料庫 hg38 和此四個單倍體中的結構變異。最後，利用之前發布的演算法，比較不同單倍體造成 EGFR 外顯子 19 缺失的能力。此篇研究為第一篇利用標靶癌症單倍體定相基因體結構差異來評估產生腫瘤主導基因的潛力。
文章中舉例了三代定序在人類癌症結構變異偵測的運用。除了上述論點外，三代定序可以直接偵測鹼基修飾的特性也於癌症研究中增添優勢。然而，目前還有一些待解決的問題，例如：(1) 三代定序所需上機濃度較高，臨床檢體通常量小且較為寶貴。 (2) 定序時的錯誤率。 (3) 跨越太大區域的基因變異可能還是無法用三代定序去完整覆蓋。 (4) 將結構變異視覺化的工具。 (5) 結構變異的偵測仰賴參考序列，不同參考序列可能會產生偏差。
參考資料
1. Hurles, Matthew E., Emmanouil T. Dermitzakis, and Chris Tyler-Smith. "The functional impact of structural variation in humans." Trends in Genetics 24.5 (2008): 238-245.
2. Sakamoto, Yoshitaka, et al. "Application of long-read sequencing to the detection of structural variants in human cancer genomes." Computational and Structural Biotechnology Journal (2021).
3. Euskirchen, Philipp, et al. "Same-day genomic and epigenomic diagnosis of brain tumors using real-time nanopore sequencing." Acta neuropathologica 134.5 (2017): 691-703.
4. Rodriguez-Martin, Bernardo, et al. "Pan-cancer analysis of whole genomes identifies driver rearrangements promoted by LINE-1 retrotransposition." Nature genetics 52.3 (2020): 306-319.
5. Shiraishi Y, Koya J, et al. “Precise characterization of somatic structural variations and mobile element insertions from paired long-read sequencing data with nanomonsv” BioRxiv 2020:1–28.
6. Cook, George W., et al. "Structural variation and its potential impact on genome instability: Novel discoveries in the EGFR landscape by long-read sequencing." PloS one 15.1 (2020): e0226340.
先前的文章中有跟大家介紹基因變異依照型態和鹼基對長度可分為多類，而三代定序在大於 50 個鹼基對的結構變異偵測上有顯著較好的結果，關於不同變異平台之間比較可參考這篇：基因變異那麼多，到底要用哪個平台定序？
結構變異在臨床上佔有重要角色，影響範圍包含孟德爾遺傳疾病、神經及精神疾病、癌症等[1]。癌症基因體多變且不穩定，當結構變異發生時，容易影響抑癌與致癌基因的功能，進而影響癌症進展或臨床上對藥物的反應。然而，三代定序在癌症領域的應用算是較其他領域成熟。這篇文章主要整理了一篇回顧文獻[2]，分享三代定序在人類癌症結構變異分析中的應用。
1. 建立一日檢測流程找出癌症結構變異的斷點[3]
利用分子檢測分類癌症種類已成為臨床上常規檢測之一，用來協助診斷、預後和治療決策。像是中樞神經系統腫瘤，目前世界衛生組織的分類明確要求進行分子檢測，如 1p/19q 缺失或 IDH 突變，以進行綜合的決策判定。目前臨床上需要多重技術來評估不同基因體和表觀基因體的改變，所需時間落於數週內，使得標準化和普及實施更加困難，無法即時做決策。這篇文獻目的以攜帶便利的 Nanopore MinION 為主，驗證臨床上可能會遇到的基因變異情況。定序策略使用低深度定序來偵測基因拷貝數目變異（copy number variants）及甲基化，而較精細部分像是單核苷酸變異（single-nucleotide variants）則使用擴增子方式進行深度定序。Nanopore MinION 能在6小時內完成 0.1X 深度的定序，搭配其他生資流程，能有效的依照癌症泛基因體做分類，區分不同原發部位的膠質瘤、髓母細胞瘤和腦轉移瘤。單核苷酸變異分析則研究了 IDH1、IDH2、H3F3A 等基因，可在2-20分鐘內產生1000X的定序深度，甚至是 GC 比例高的 TP53 或TERT 啟動子區域，也可運用此流程檢測其基因變異（圖一）。此篇文獻提供的檢測策略相較於過去的雜合式策略與現今技術，能夠更快速的為每位癌症患者提供精準醫療，也適合運用於資源有限的環境中。
【圖一】
2. 偵測轉座子導致的結構變異
轉座子（transposon）能夠在基因體中透過轉錄或反轉錄的方式，加上內切酶的作用後，出現在其他基因座上，而這種「跳來跳去」的方式有時會造成基因體上的結構變異。癌症泛基因體計畫（The Pan-Cancer Analysis of Whole Genomes, PCAWG）為了研究體細胞內轉座子在致癌過程中扮演的角色，研究了 38 種癌症、 2,954 個癌症基因體的體細胞逆轉錄（somatic retrotransposition）作用機制[4]。共找出 19,166 個逆轉錄點，其中有35%會造成影響。然而，轉座子像是LINE-1最多可造成 6 kb 的插入序列，用長讀長定序使得檢測上更準確。在一篇2020年預印本文獻中，發布了一個偵測工具稱為『nanomonsv』[5]。Nanomonsv可用來檢測癌症與其相對應正常組織中移動元素插入造成的結構變異，利用對應到參考序列的方式，找到假設的結構變異與可支持其變異的定序片段，而結構變異的斷點則由one-time jump Smith–Waterman演算法來辨識。最後，假設的結構變異再經由重新對應至參考文獻中的結構變異序列、和正常組織間的比較等方式做確認（圖二）。利用這套流程即可研究所有癌細胞中的LINE-1插入異常。
【圖二】
3. 單倍體定相與結構變異
在癌症基因體中，定相技術可用來檢測等位基因上的單核苷酸或結構變異。最後一篇文獻與講述肺腺癌中常見變異：表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor, EGFR）外顯子 19 缺失[6]。作者利用 PacBio CCS 模式定序兩個肺癌病人檢體共四個單倍體，並且以WhatsHap做單倍體定相。定序 EGFR 及其附近正負 500 kb 的距離，發現一非編碼區域與非小細胞肺癌常見EGFR突變區域有著超過 90% 的相似度，後續利用其他方式驗證了此非編碼區與 EGFR 基因之間的交互作用會影響其基因活性進而變成腫瘤主導基因（cancer-driver gene）。除此之外，此項研究還找到了之前未於人類基因參考資料庫 hg38 和此四個單倍體中的結構變異。最後，利用之前發布的演算法，比較不同單倍體造成 EGFR 外顯子 19 缺失的能力。此篇研究為第一篇利用標靶癌症單倍體定相基因體結構差異來評估產生腫瘤主導基因的潛力。
文章中舉例了三代定序在人類癌症結構變異偵測的運用。除了上述論點外，三代定序可以直接偵測鹼基修飾的特性也於癌症研究中增添優勢。然而，目前還有一些待解決的問題，例如：(1) 三代定序所需上機濃度較高，臨床檢體通常量小且較為寶貴。 (2) 定序時的錯誤率。 (3) 跨越太大區域的基因變異可能還是無法用三代定序去完整覆蓋。 (4) 將結構變異視覺化的工具。 (5) 結構變異的偵測仰賴參考序列，不同參考序列可能會產生偏差。
參考資料
1. Hurles, Matthew E., Emmanouil T. Dermitzakis, and Chris Tyler-Smith. "The functional impact of structural variation in humans." Trends in Genetics 24.5 (2008): 238-245.
2. Sakamoto, Yoshitaka, et al. "Application of long-read sequencing to the detection of structural variants in human cancer genomes." Computational and Structural Biotechnology Journal (2021).
3. Euskirchen, Philipp, et al. "Same-day genomic and epigenomic diagnosis of brain tumors using real-time nanopore sequencing." Acta neuropathologica 134.5 (2017): 691-703.
4. Rodriguez-Martin, Bernardo, et al. "Pan-cancer analysis of whole genomes identifies driver rearrangements promoted by LINE-1 retrotransposition." Nature genetics 52.3 (2020): 306-319.
5. Shiraishi Y, Koya J, et al. “Precise characterization of somatic structural variations and mobile element insertions from paired long-read sequencing data with nanomonsv” BioRxiv 2020:1–28.
6. Cook, George W., et al. "Structural variation and its potential impact on genome instability: Novel discoveries in the EGFR landscape by long-read sequencing." PloS one 15.1 (2020): e0226340.
圖爾思生物科技 / 微生物體研究中心
許瑄珉 文案
