微生物甲基化特徵的應用-老裁縫的剪刀依然鋒利

在生物學研究中，科學家倚賴各種工具來深入探索生命的奧秘。近年來，基因編輯神器「CRISPR」技術成為研究中的巨星，其背後的核心工具Cas9蛋白能根據引導RNA (guide RNA)的指引，在目標DNA序列中進行精準的剪切，被科學家暱稱為神剪。

然而，在此之前，同樣具有DNA剪切功能的限制酶早已被廣泛應用於各類生物學研究中。這些酶能夠辨識、剪切特定序列，為科學家提供了豐富的資訊，例如早在1970年代，美國科學家Daniel Nathans即利用限制酶描繪出了simian virus 40的限制酶切位圖譜 (cleavage map)，開啟了後續一系列基因功能學的研究。隨著時間的推移，限制酶持續在生物學領域發揮著重要作用，並且在新的研究支持下不斷演進和創新，推動了DNA重組、基因工程、及遺傳工程的發展。

最近，美國西奈山伊坎醫學院的研究團隊於2024年初在「Nature Methods」上發表了一項名為mEnrich-seq(microbe enrichment sequencing)的技術。這項技術的基礎即是利用限制酶來剪切非目標序列，以有效富集特定細菌基因體。這不僅有助於篩選目標菌種，還能在相同的定序資料量下提高目標菌種的數據佔比，提高分析效能。

但也不是一般常見的限制酶都可以達到相同的效果，而是要透過一群稱作甲基化敏感性限制酶（Methylation-sensitive restriction enzymes，簡稱MSREs）才能夠實現。MSREs無法剪切具有特定甲基化修飾的序列位置，因此當目標菌種的基因體帶有特定甲基化修飾時，序列得以被保留下來，參與後續的定序流程。因此，為達到富集特定菌種的序列，這時選用合適的MSREs就變成很重要的事。

近幾年可用於解密微生物甲基化圖譜的工具越來越多，各家的定序平台都有相應的方式偵測序列中甲基化的位置與種類，其中三代定序平台如PacBio及Nanopore，其中Nanopore定序更是可以直接透過序列通過奈米孔時偵測的訊號類型，來區分甲基化類型，包括微生物中常見的N6-甲基腺嘌呤（6mA）、N4-甲基胞嘧啶（4mC）和真核生物中常見的5-甲基胞嘧啶（5mC）等。該團隊在2021年就發表利用nanodisco這個軟體搭配Nanopore平台的定序結果來找出目標細菌甲基化修飾的種類以及位置，藉此累積細菌甲基化修飾的資料，透過細菌甲基化圖譜的協助就能挑出合適的MSREs。
 
偵測低菌量樣本的新選擇
依據Cao et al. (2024) 的文獻發表，mEnrich-seq這項技術可成功應用於尿液和腸道採檢樣本。以尿液樣本中的大腸桿菌為目標菌為例，利用mEnrich-seq 技術能將大腸桿菌的基因體定序比例從0.91%提升至70.75%，富集倍數高達70倍，甚至達到99.97%以上的大腸桿菌基因組覆蓋率。當感興趣的菌種甲基化模式未知時，亦可採用 de novo 的策略進行研究，例如在成人糞便樣本的測試中，先利用PacBio定序平台進行低深度定序，以了解樣本的細菌類群和可能的甲基化修飾特徵，選定適用的MSRE後進行mEnrich-seq，可成功富集所感興趣的細菌的偵測比例，像是Alistipes finegoldii (8.7X) 與Bacteroides ovatus (3.1X)。在這項技術中可降低背景序列，同時降低了細菌基因體組裝的困難度與成本。實驗結果顯示在模擬和實際樣本中，mEnrich-seq均實現了目標DNA的有效富集，表現出高特異性和敏感性。

這個技術的泛用性高嗎？
儘管已經知道了目標細菌的甲基化修飾類型，會不會找不到合適的限制酶呢？研究指出通過4601株已知甲基化圖譜的細菌，平均每株細菌具有三種甲基化修飾特徵，其中約68%的細菌至少已有一種商用的限制酶可供選擇應用。雖然這並不表示現階段這項技術適用於所有特定微生物定序的實驗設計，但這項技術強調富集微生物序列的能力，及其應用在臨床檢測和微量微生物種探索的潛力不可忽視，令人期待。
 
隨著更多的微生物基因組被揭露與累積更多的甲基化資料後，這項技術有望幫助我們更深入地了解微生物的世界。mEnrich-seq技術的發展無論在降低研究成本、擴展應用領域、及加速臨床檢測工具的發展上，為微生物研究提供了更多選擇，有助於我們更深入地探索微生物與其宿主之間的互動關係。老裁縫的剪刀也是可以剪出新花樣~
 

參考文獻

• Cao, L., Kong, Y., Fan, Y., Ni, M., Tourancheau, A., Ksiezarek, M., Mead, E. A., Koo, T., Gitman, M. R., Zhang, X., & Fang, G. (2024). mEnrich-seq: Methylation-guided enrichment sequencing of bacterial taxa of interest from microbiome. Nature Methods 21, 236-246.
• Tourancheau, A., Mead, EA., Zhang, X-S., Fang, G. (2021) Discoverying multiple types of DNA methylation from bacteria and microbiome using nanopore sequencing. Nature Methods 18, 491-498.