29 2022．12

解"泌"健康：液態活檢的外泌體迎向臨床診斷新趨勢

外泌體 (Exosome) 最初被發現於綿羊的網狀細胞，由其所釋放；大量的研究工作隨後衍生，研究發現Exosome幾乎存在於所有體液中：血液、尿液、腦脊液、唾液、胸腔積液、腹水、羊水、母乳和支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid）。外泌體起源於細胞內膜，通過多泡體而形成；如此特殊的生成途徑使外泌體包含了母細胞為特徵的各種分子，包括核酸（DNA、mRNA、microRNA（miRNA）、lncRNA、circRNA等）、蛋白質和脂質，而這些分子也在外泌體，其脂質雙層封閉結構的保護下，通過循環系統進行遠距離運輸至其他組織、甚至器官。

想當然，外泌體是液態活檢的重要組成物之一，且外泌體在最廣泛使用的液態活檢：
血液中的占比遠高於腫瘤衍生血小板 (tumor‐educated platelets, TEPs)、循環腫瘤細胞（circulating tumor cells, CTCs）和循環腫瘤DNA（circulating tumor DNA, ctDNA），且保存容易、穩定。在過去的10年裡，尤其是在2018年，外泌體作為診斷的生物標誌物載體引起了外顯子研究的最大興趣。

截至2020年1月的PubMed搜索，過去5年中有關外泌體診斷功效的出版物，以MeSh關鍵字搜尋 "外泌體 "或 "小細胞外囊泡"、"診斷 "或 "生物標誌物 "和 "液體活檢"，有88篇關於DNA的相關出版物，695篇關於RNA（包括74篇關於mRNA，534篇關於microRNA，52篇關於lncRNA，14篇關於cyclRNA），以及824篇關於蛋白質。蛋白質是外泌體被研究最多的內容，其次是miRNA。

在使用或探索外泌體作為診斷生物標誌物時，外泌體的純化和分離過程至關重要。超高速離心法曾經是黃金標竿、研究外泌體的入門心法，但純化方法日益月新，實驗者可根據自己的實驗目的、時間性、工作習慣選擇分離方案：以粒徑與聚合物來純化外泌體、並同時有效去除蛋白質、鹽類等污染的size exclusion chromatography (SEC)與tangential flow filtration (TFF)；最簡單、高通量和快速的聚合物沉澱 (polymer precipitation)；能夠得到最純外泌體樣本的免疫親合法 (immunoaffinity)。

面對外泌體在未來的發展性，圖爾思通通準備好了：

一、提供高純度沉澱法的外泌體分離試劑交給 - 自有品牌TOOLS

一出手就要方便、好用，提供高純度的沉澱法的外泌體分離試劑，並根據樣品的複雜性調整配方

>> TOOLS Exosome Isolation

二、推出免疫親合法，為精準療法而生的 - CROYEZ

高度特異性的免疫親合法套組，減少非特異性的雜質，提高樣品的純度
>> Exo-Max Exosome Purification Kit(#C08010-K01)

三、科學友善純化管 (TFF & SEC) - HansaBioMed

HBM致力於外泌體研究的提供高效的材料，如TFF與SEC管等材料，這些材料具有多種體積可以選擇，且可重複使用 5- 20 次。TFF與SEC專為外泌體的分離、濃縮、純化而設計，並且被證實兩種純化系統非常適合作為多體學(Omics)的研究，達到更高純度的Exosome。

>> TFF & SEC Exosome Purification Kit

四、圖爾思技術服務中心，使用不同方法學平台進行外泌體的身分鑑定。

1) 圖爾思技術服務中心提供前瞻技術 Nano Flow cytometry (NFC) 分析服務，此服務利用流式細胞儀(Nano Flow cytometry)的原理，來揭示外泌體的多重參數，並使用超靈敏度、高重複性的儀器NanoFCM，測定>40nm大小的顆粒，並可獲得粒徑大小(Size)、濃度(Concentration)、搭配免疫螢光染色分析表面蛋白(Surface marker)，其中CD9、CD63與CD81為最常見的生物標誌。

探索外泌體的微觀世界

>>Nano Flow Cytometry (NFC)分析服務

2) NanoSight NTA系統支持ISO19430：2016顆粒追踪分析（PTA）方法和ASTM E2834-12（2012）通過利用布朗運動(Brownian motion)的方式來側凌粒徑大小的方法學。

精準追蹤微粒的大家長

>> NTA粒徑&濃度檢測

3) 二維凝膠電泳（two-dimensional gel electrophoresis）和液相色譜串聯質譜（liquid chromatography coupled tandem mass spectroscopy, LC-MS）時常被應用於分析外泌體的蛋白組成。圖爾思技術服務中心提供質譜分析技術的蛋白質體學服務 ；我們的技術部門在操作質譜儀和處理各種類型的樣品方面有超過10年的經驗，並且在處理外泌體方面有豐富的經驗。

除了從外顯子中提取和鑑定總蛋白外，我們的服務團隊還提供exsome shaving的特別蛋白質萃取流程，只提取並特別分析外泌體的表面蛋白；後續可進行定性 (了解蛋白組成)與定量分析，以及豐富多元的生物資訊服務。

想了解更多關於我們的MS蛋白質組學服務

>> MS Proteomics of Exosome

4) 圖爾思2022年底率先與泌碼科技(Secretch)合作，其利用Proximity binding assay (PBA)技術，與特別設計的Antibody code與rolling circle amplication (RCA) barcoding，兩組編碼組成能夠辨識單一外泌體之表面蛋白的辨識碼；這樣獨特設計能夠單次、每個樣本有效分析10^5-10^6外泌體，且是每一個獨立的外泌體的表面蛋白組成，且無論是純化的外泌體樣本，還是珍貴液態檢體都可以直接進行委託服務，從而精準地捕捉疾病發生的早期訊號與建立疾病風險預警機制。

解析單一外泌體表面蛋白組(Single exosome Proteomics)分析

>>單外泌體表面蛋白組(PBA)檢測服務

5) 外泌體中的miRNA 被證實在多種疾病中是可作為在早期臨床診斷有用的生物標誌物，如：癌症、感染 (來自免疫細胞的外泌體)、代謝異常、神經退行性疾病等，且外泌體中的miRNA的含量穩定而豐富，是診斷指標的開發重點。對於想要找出與疾病顯著相關的miRNA目標的研究階段，TOOLS miRNA RT-qPCR analysis system能提供了準確和令人滿意的結果。

TOOLS miRNA RT-qPCR analysis system的核心是獨家開發設計的、僅針對成熟miRNAs的環型RT引物 (primer)，搭配序列兼容的qPCR引物和TaqMan定量螢光探針，對目標成熟miRNA的高度特異性識別。

目前已有預先設計和驗證的 primer/probe sets，針對人類mature miRNA有超過200個，小鼠100個，大鼠80個；另可以客製設計，亦經過每批驗證才會出貨，隨貨檢附Certificate of authenticity，為成功的實驗打下基礎。

TOOLS miRNA RT-qPCR analysis system易於使用，採用廣為人知、簡單的2 step RT-qPCR 操作程序，就可快速、敏感和特異地分析 mature miRNA的表達量。

探索如何使用TOOLS miRNA RT-qPCR檢測系統

>>Exosome miRNA RT-qPCR analysis

Reference

Zhou, B., Xu, K., Zheng, X. et al. Application of exosomes as liquid biopsy in clinical diagnosis. Sig Transduct Target Ther 5, 144 (2020).
Huda MN, Nafiujjaman M, Deaguero IG, Okonkwo J, Hill ML, Kim T, Nurunnabi M. Potential Use of Exosomes as Diagnostic Biomarkers and in Targeted Drug Delivery: Progress in Clinical and Preclinical Applications. ACS Biomater Sci Eng. 2021 Jun 14;7(6):2106-2149.
Li S, Yi M, Dong B, Tan X, Luo S, Wu K. The role of exosomes in liquid biopsy for cancer diagnosis and prognosis prediction. Int J Cancer. 2021 Jun 1;148(11):2640-2651.
Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. J Extracell Vesicles. 2018 Nov 23;7(1):1535750.
Wu, D., Yan, J., Shen, X. et al. Profiling surface proteins on individual exosomes using a proximity barcoding assay. Nat Commun 10, 3854 (2019).
Mirzaei, R., Babakhani, S., Ajorloo, P. et al. The emerging role of exosomal miRNAs as a diagnostic and therapeutic biomarker in Mycobacterium tuberculosis infection. Mol Med 27, 34 (2021).
Yao ZY, Chen WB, Shao SS, Ma SZ, Yang CB, Li MZ, Zhao JJ, Gao L. Role of exosome-associated microRNA in diagnostic and therapeutic applications to metabolic disorders. J Zhejiang Univ Sci B. 2018 Mar.;19(3):183-198.

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