BIOTOOLS檔案_全基因體組裝，成功關鍵都在這！

▌案件大綱

• 品項: Whole Genome Sequencing / Iso-Seq
• 定序平台: PacBio Sequel IIe
• 樣品物種/類型: 昆蟲 DNA / RNA
• 欲解決案件難題: 客戶希望進行昆蟲基因體的發表，因此委託圖爾思進行三代定序和分析，但是在樣品製備步驟就卡關，準備的樣品一直無法通過品質檢驗。
• 解方: 經仔細盤查樣品製備流程，給予有效的改善建議，並根據實驗情況設計定序流程，最終取得連續性與完整度都很棒 (超出預期) 的組裝基因體。

▌案件詳述
 

動植物全基因體定序，可應用於疾病模型研究、基因體功能分析、物種保存策略、演化關係探討、特定環境適應研究，以及動植物育種等領域當中。這些研究主題都有一個共通點，就是需要一個準確、可信賴的參考基因體。隨著三代定序成本逐年下降，搭配強大的長讀長優勢，越來越多科學家將它視為組裝基因體的標準配備，並投身參考基因體的發表行列。在您也被三代定序的強大威力所擄獲時，您是否曾經想過：
我也想用三代定序進行全基因體定序，我應該怎麼準備樣品呢？

本次案件分享的客戶，對於昆蟲個體間的表型差異深感興趣，但是該物種沒有已知的參考基因體，鄰近物種的參考序列也不適用，因此希望先發表組裝基因體，作為後續研究重要的參考依據。

由於客戶樣品稀有不易準備，加上單一蟲體能萃取的DNA總量有限，經過討論決定使用PacBio 低 DNA 總量建庫流程 (HiFi Library from Low DNA Input) 進行實驗。然而客戶準備的 DNA 純度，卻無法順利通過樣品檢測的門檻。圖爾思三代定序領域應用科學家 (FAS) 與客戶討論核酸製備流程，發現魔鬼藏在細節裡，造成核酸純度不佳的原因，竟然在實驗最後一步。為了提高核酸回收總量的添加物，在此時此刻卻拖累了核酸品質。除此之外，FAS 注意到採樣方式也需要修正，建議客戶調整取樣方式，以降低影響核酸品質的因素。

客戶採納建議重新萃取的核酸，順利通過檢測門檻，並取得高品質的定序結果，有超過一半的數據準確度達到 QV40，並且 HiFi reads 平均長度超過 10 kb。於是進行從頭組裝 (de novo assembly) 分析，圖爾思使用兩種不同組裝工具測試，根據結果判斷本次定序深度不足，造成組裝的 contig N50 未達到令人滿意的水準。

由於客戶希望組裝基因體的連續性，至少 contig N50 要超過 1 Mb。在提供客戶測試結果，和詳細的報告解說後，建議增加定序深度以提升組裝基因體的連續性，並且推薦使用重新製備的 DNA 建庫樣品再次定序，而不使用剩餘的 DNA 建庫樣品進行加測，這個方法是為了增加序列組成的多樣性，避免數據集中在特定基因體區域。重新定序的 HiFi reads 平均長度接近 10 kb，並且過半的數據準確度達到 QV42，依舊展現高品質的定序結果。

接著進行兩次數據的合併組裝，contig N50 上升到 14.5 Mb，顯示基因體連續性有飛躍性的進步，BUSCO 判斷基因體完整性達到 98.6%，定序深度超過 30 倍。

因為基因體組裝結果超乎期待，客戶後續也委託圖爾思進行Iso-Seq實驗，希望用於組裝基因體註釋。由於真核生物的基因包含內含子 (intron)，不易精確預測基因位置，使用轉錄本序列進行註釋是常用的策略，尤其是 PacBio 推出的 Iso-Seq 全長轉錄體定序，提供的數據能更精確的註釋基因位置，也能用於 RNA 選擇式剪切 (alternative splicing) 的研究。本次案件完成的昆蟲 Iso-Seq 定序，產出超過 4 M HiFi reads，其中超過一半的數據準確度達到 QV41，高達 98% 的數據能比對到組裝基因體，再次展現圖爾思高品質的定序結果。

最終基因體註釋分析順利完成，FAS 也提供詳細的報告解說，和後續所有的疑問回覆。

您也有樣本想進行基因體發表嗎? 是否樣本準備上遇到困難? 或是因為不熟悉技術而猶豫不前? 快聯繫圖爾思，了解更多三代定序的解決方案。



 

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