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2020．06
10x Genomics 新知分享-單細胞定序平台在COVID-19研究上的相關應用
原創文章 引用請註明出處 [新知分享] 10x Genomics 單細胞定序平台在COVID-19研究上的相關應用
自從2019年底爆發新冠肺炎病毒COVID-19全球的大流行之後，有非常多的專家學者與研究團隊紛紛投入疫苗的研製、藥物的製造與快篩試劑的研發。除此之外，也越來越多的學者將10x Genomics的單細胞定序的平台應用在這個全球矚目的議題上面，藉由此項技術的特性，此類的研究主要可以分為幾個方向：
1. 了解病毒的受體ACE2在不同細胞中的表現程度
ACE2是COVID-19用來感染細胞所需的受體，為了更了解病毒的感染途徑，近來已有許多的文獻針對不同的細胞組織來確認ACE2的基因表現量。在今年五月發表於EMBO Journal的文章中 (Ref. 1) 就對肺部(39778顆細胞)與氣管分枝(17521顆細胞)等不同部位中的ACE2及TMPRSS2等與病毒感染相關的基因進行了深入的探討，從結果中也了解到這兩個基因在不同的細胞形態中的表現情形。另外，在此研究中也發現在支氣管的細胞中，有一種在分化過程中短暫出現的分泌細胞(secretory cell 3)具有高度的ACE2及TMPRSS2表現，且在此細胞中，許多與RHO GTPase相關的pathway都被高度活化，而其中包含了許多與病毒的形成以及免疫反應相關的pathway。
另一篇同樣是在今年五月發表在Scince Immunology的文章中(Ref. 2)，則是針對小腸細胞中ACE2的表現情況進行了深入的探討。結果顯示在小腸中的Enterocytes ( Cd26+Epcam+ Cd44−Cd45− )具有高度的ACE2表現，是屬於病毒具有高度感染性的細胞種類。此外，在此研究中也發現在這些Enterocytes中，TMPRSS2與TMPRSS4在病毒的感染上同時扮演的關鍵的角色。
2. 抗病毒抗體的篩選與製備
篩選出針對病毒的專一抗體或甚至是中和抗體是開發出病毒快篩試劑以及病毒抗體藥物的關鍵步驟。在過去，從疾病恢復期病患的周邊血液中篩選出對病毒具有專一性的B細胞來篩選專一性的抗體是最常被使用的一個方式。然而此步驟需要針對單一B細胞進行分析，所以非常的耗時。然而近來因為10x Genomics單細胞定序平台在免疫細胞研究上的特點，因此大大地縮短了整個研究的時程。在今年五月發表於Cell上的文章中，為了有效的挑選出對COVID-19具有專一性的B細胞，學者們利用Biotin-labeled的病毒S protein以及Biotin-labeled的病毒的RBD protein，從60個COVID-19感染的恢復期病人中(包含六個不同的批次)分離出能與病毒結合的B細胞。 並利用10x Genomics的單細胞定序平台對這些B細胞進行了Single-cell RNA sequencing以及Single-cell VDJ sequencing。
為了更有效的篩選出病毒的中和抗體，所以作者利用VDJ定序的特性，從結果中僅挑選與病毒反應較有相關的IgG1 clonetype，總共8558種。
同時從Single-cell RNA sequencing的結果中，利用每個細胞的基因表現圖譜，作者能將所挑選出來的B細胞clonetype進一步的區分成naive B細胞、exhausted B細胞、memory B細胞等不同的細胞型態，為了更有效的篩選出病毒的中和抗體，因此作者從中進一步的挑選出僅屬於memory B cell且同時在B cell receptor的variable region 具有高於2%突變率的clone type。
自從2019年底爆發新冠肺炎病毒COVID-19全球的大流行之後，有非常多的專家學者與研究團隊紛紛投入疫苗的研製、藥物的製造與快篩試劑的研發。除此之外，也越來越多的學者將10x Genomics的單細胞定序的平台應用在這個全球矚目的議題上面，藉由此項技術的特性，此類的研究主要可以分為幾個方向：
1. 了解病毒的受體ACE2在不同細胞中的表現程度
ACE2是COVID-19用來感染細胞所需的受體，為了更了解病毒的感染途徑，近來已有許多的文獻針對不同的細胞組織來確認ACE2的基因表現量。在今年五月發表於EMBO Journal的文章中 (Ref. 1) 就對肺部(39778顆細胞)與氣管分枝(17521顆細胞)等不同部位中的ACE2及TMPRSS2等與病毒感染相關的基因進行了深入的探討，從結果中也了解到這兩個基因在不同的細胞形態中的表現情形。另外，在此研究中也發現在支氣管的細胞中，有一種在分化過程中短暫出現的分泌細胞(secretory cell 3)具有高度的ACE2及TMPRSS2表現，且在此細胞中，許多與RHO GTPase相關的pathway都被高度活化，而其中包含了許多與病毒的形成以及免疫反應相關的pathway。
另一篇同樣是在今年五月發表在Scince Immunology的文章中(Ref. 2)，則是針對小腸細胞中ACE2的表現情況進行了深入的探討。結果顯示在小腸中的Enterocytes ( Cd26+Epcam+ Cd44−Cd45− )具有高度的ACE2表現，是屬於病毒具有高度感染性的細胞種類。此外，在此研究中也發現在這些Enterocytes中，TMPRSS2與TMPRSS4在病毒的感染上同時扮演的關鍵的角色。
2. 抗病毒抗體的篩選與製備
篩選出針對病毒的專一抗體或甚至是中和抗體是開發出病毒快篩試劑以及病毒抗體藥物的關鍵步驟。在過去，從疾病恢復期病患的周邊血液中篩選出對病毒具有專一性的B細胞來篩選專一性的抗體是最常被使用的一個方式。然而此步驟需要針對單一B細胞進行分析，所以非常的耗時。然而近來因為10x Genomics單細胞定序平台在免疫細胞研究上的特點，因此大大地縮短了整個研究的時程。在今年五月發表於Cell上的文章中，為了有效的挑選出對COVID-19具有專一性的B細胞，學者們利用Biotin-labeled的病毒S protein以及Biotin-labeled的病毒的RBD protein，從60個COVID-19感染的恢復期病人中(包含六個不同的批次)分離出能與病毒結合的B細胞。 並利用10x Genomics的單細胞定序平台對這些B細胞進行了Single-cell RNA sequencing以及Single-cell VDJ sequencing。
為了更有效的篩選出病毒的中和抗體，所以作者利用VDJ定序的特性，從結果中僅挑選與病毒反應較有相關的IgG1 clonetype，總共8558種。
同時從Single-cell RNA sequencing的結果中，利用每個細胞的基因表現圖譜，作者能將所挑選出來的B細胞clonetype進一步的區分成naive B細胞、exhausted B細胞、memory B細胞等不同的細胞型態，為了更有效的篩選出病毒的中和抗體，因此作者從中進一步的挑選出僅屬於memory B cell且同時在B cell receptor的variable region 具有高於2%突變率的clone type。
從這些B細胞clonetype中，作者進一步的篩選出七株具有高度中和病毒能力的抗體。此研究藉由了10x Genomics的單細胞定序平台提供了一個High-throughput的方法來進行抗體的篩選平台，以期後續可以應用在不同的感染症上。
參考文獻：
1. EMBO Journal, Apr 2020. Soeren Lukassen et al. SARS-CoV-2 receptor ACE2 and TMPRSS2 are primarily expressed in bronchial transient secretory cells.
2. Science Immunology, May 2020. Ruochen Zang et al. TMPRSS2 and TMPRSS4 promote SARS-CoV-2 infection of human small intestinal enterocytes.
3. Cell, May 2020Yunlong Cao et al. Potent Neutralizing Antibodies against SARS-CoV-2 Identified by High-Throughput Single-Cell Sequencing of Convalescent Patients’ B Cells.
參考文獻：
1. EMBO Journal, Apr 2020. Soeren Lukassen et al. SARS-CoV-2 receptor ACE2 and TMPRSS2 are primarily expressed in bronchial transient secretory cells.
2. Science Immunology, May 2020. Ruochen Zang et al. TMPRSS2 and TMPRSS4 promote SARS-CoV-2 infection of human small intestinal enterocytes.
3. Cell, May 2020Yunlong Cao et al. Potent Neutralizing Antibodies against SARS-CoV-2 Identified by High-Throughput Single-Cell Sequencing of Convalescent Patients’ B Cells.
圖爾思生物科技 / 微生物體研究中心
莊景凱 文案
