RNAi選擇指南

RNAi (RNA interference)干擾是真核生物所獨有的基因沉默現象，在自然界中是真核生物調控內原基因表現與抵抗外源核酸入侵的自我保衛機制。主要是藉由非小編碼RNA(Small non-coding RNA，sncRNA)來調控mRNA，造成降解、抑制轉錄等，使得mRNA無法轉譯成蛋白質的轉錄後基因靜默作用（post transcriptional gene silencing, PTGS）。

RNAi可以分為外源性與內源性2種，外源性有siRNA/shRNA與內源性的miRNA:

• siRNA(small interfering RNA):

主要都是外來的雙股RNA分子，藉由轉染(Transfection)或電穿孔(Electroporation)方式送入細胞，在細胞內被RNase III (如Dicer) 切割成21～25個核甘酸大小的單股siRNA，反股的siRNA會與目標mRNA完全互補結合，導致mRNA降解，停止轉譯等基因靜默的現象。siRNA具有專一性高、不易脫靶、半衰期短(數天降解)等特性，可用來短暫調控基因表現等實驗。

• shRNA(Short hairpin RNA):

具有短髮夾(Short hairpin)的雙股RNA分子，在轉染或感染的細胞核中合成，從細胞核送出到細胞質後會被Dicer切割成21～25個核甘酸大小的單股siRNA，在與目標mRNA互補結合，導致mRNA降解。大部shRNA都是通過載體轉錄而來，一般會使用細菌或病毒載體，shRNA利用轉染或者病毒感染等方式被送入目標細胞的細胞核內，而利用病毒為載體可以穩定地嵌合到基因組中，形成穩定表現的細胞株。
siRNA或shRNA的選擇，取決於正在使用的細胞類型，專染或感染的難易度與敏感度，以及實驗表現時間長度等。siRNA是短暫表現，無法長時間維持和檢測，而且無法遺傳到下一代，而shRNA可以整合到細胞基因組中，子代仍能發揮作用。常見的轉染、電穿孔等方法都是短時間作用，而慢病毒(Lentivirus)等可將shRNA穩定嵌合到細胞基因組中長時間持續表達。

• miRNA（microRNA）:

主要來源自生物的基因組，在細胞核內轉錄形成pri-miRNA，具有類似髮夾的莖環狀結構的雙股RNA，pre-miRNA被轉運到細胞質中，在細胞質中被Dicer剪切成長度約為19-25個核甘酸的成熟的單股RNA(mature miRNA)。miRNA主要通過不完全配對的方式與目標mRNA結合，抑制目標mRNA的轉譯或誘發mRNA降解，來調控基因表現或抑制基因表現。

人工合成的miRNA又可以分為Mimics與Inhibitor兩種:

(1) Mimics: 模仿生物體內源性miRNA的序列，為人工合成雙股RNA，轉染進細胞增強miRNA與目標基因結合的效果，促進或抑制轉譯作用而影響後續蛋白表現。
(2) Inhibitor: 為miRNA的單股反股序列，主要目標為與內源性miRNA互補結合，而抑制內源性mature miRNA作用。

siRNA、shRNA和miRNA三者的成熟體都是長度在20-25個核甘酸的單股RNA，siRNA一般是人工合成的雙鏈RNA，shRNA、miRNA則是通過內原生成的短髮夾結構雙鏈RNA，三者再經由Dicer切成單股作用的RNA分子。siRNA和shRNA會與目標mRNA完全互補配對，降解目標mRNA,而miRNA絕大多數是與目標mRNA不完全互補的結合，造成目標mRNA降解或者抑制蛋白轉譯，也會更容易有脫靶情況發生。

 

使用者該如何選擇siRNA、shRNA或者miRNA？

1. siRNA: 實驗者所使用細胞便於轉染或電穿孔，著重在實驗週期，快速觀察到目標基因抑制表現，或者想通過螢光或其他分子標記檢測mRNA等
2. shRNA: 實驗人員想徹底沉默目標基因，或者想通過誘導在特定時期產生干擾效應，或者想建立穩定表現的細胞株，或者植物基因等。
3. miRNA: 內源非編碼的miRNA調控研究，miRNA對某表現所有調控路徑的影響，目標基因不能夠被完全沉默，否則會導致細胞死亡，如housekeeping基因等

RNAi技術具有高效、快速、高度專一性等優點，是研究基因功能、信號傳遞路徑和臨床治療疾病的有力工具。

 

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