如何快速且精確地完成亞克隆(Sub-cloning)

克隆(cloning)技術是一個古老又神奇的技術，能將想要研究的基因單獨分離與放大至研究體系中，雖然克隆(cloning)技術在現代來說已經是一個稀疏平常的技術，但是其中卻有些眉角能讓技術更深入成功率提高，因此今天這篇文章主要藉由圖爾思SuperLab於克隆(cloning)技術的經驗跟大家分享如何快速精準地完成克隆(cloning)或是亞克隆(sub-cloning)實驗。由於核酸合成儀越來越強大及選殖技術的多元化下，直接從資料庫找到特定核酸序列便可以基因合成法將核酸片段接合到載體DNA上，省去傳統方式從genome或是mRNA”釣出”特定的核酸片段或基因片段。但後續實驗因為目的不同需要使用不同的載體時就需要進行亞克隆，此過程需要進行核酸的酵素切割與接合或同源重組的步驟，再將載體送入勝任細胞中進行選殖及增殖的步驟，必要時進行定序確認無點位突變，最後挑選正確的選殖株後再將載體大量放大後純化備用。

上述技術以發展超過一個世代的時間了，是分子生物學入門必學習的技術之一，但常常會遇到的狀況是有人挑了幾十顆菌落卻一個都沒成功，但也有人隨便挑兩三個顆就都是成功的，這不是運氣問題，只要注意以下幾點，除了可以輕鬆挑到亞克隆株外更可以節省很多時間:

1. 選殖位點限制酵素的選擇：在複合選殖位點區域(MCS)上有許多切位可以選擇，通常建議選擇兩端皆為可形成突出位(sticky end)的限制酵素切位來當作選殖位。當在做接合(ligation)反應時，sticky end比blunt end的切位來的專一且接合機率大，成功率會上升。限制酵素切位選擇還必須注意到這些切位是欲選殖DNA片段上面沒有的，且在載體上是單一切割位(在MCS上的皆是)。
2. 限制酵素的作用注意：選用單一buffer的限制酵素系統除了可以省去雙重酵切的時間外，另一方面其效率也好很多。欲切割的載體DNA及目標DNA片段所需要的量不需要很多，以起始量1μg就一定夠用，使用1 U的酵素就可在一小時內完成，過多的核酸會造成酵切時間拉長、限制酵素劑量增加，最重要的若沒有完全切割，後造成後續接合率的下降。酵切完畢的核酸需進行純化，沖提的時候建議使用二次水取代TE buffer。
3. 接合反應(ligation)的設定：反應體積在10 μl下總核酸量以不超過100 ng為原則，根據載體及目標DNA片段長度比例換算其分子數量比混合。通常完美的接合反應 1 ng的載體DNA就足夠了，再加入5倍分子數量的接合DNA片段，於22度環境下作用半小時就可以進行細胞轉型(transformation)步驟了。
4. 細胞轉型時挑選高效率的勝任細胞可以達到高轉型率，另外可以節省加入LB培養的時間。當隔天的菌落生成後，培養少量菌液三小時後，就可進行colony PCR先快速確認是否有接合成功，再從中挑選兩至四個候選進行質體的抽取與酵切確認，視後續實驗設計評估是否需要進行定序確認。

這些小地方若是有確實的執行，除了快速成功率高，更重要的是不需要花費很多時間養很多候選的選殖株與純化其質體來確認，亞克隆技術的最後目標不就是挑中一個正確的選殖株就是成功了嗎?

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