【代謝體技術分享】代你看看OxO_膽酸新發現！
你知道腸道微生物是怎麼影響宿主的嗎？
腸道微生物在近幾年來，許多研究都提出腸道微生物其實干預了宿主的健康甚至是調控宿主基因表現。目前的研究大多觀察到某些疾病與某些微生物有關，但確切是怎麼影響的、藉由什麼影響都還有待確認。
微生物代謝物就是其中一個值得探討的議題，在好幾年前的研究就已知腸道內的短鏈脂肪酸(Short chain fatty acids)和膽酸(Bile acids)，是藉由腸道微生物利用腸道內的食物，經過一番作用後而得來的。這兩類代謝物在宿主內的含量已知與某些疾病和特定菌群有關。這次代你看看就要先來探討膽酸的部分，跟各位分享這篇今年年初發表於Nature的文章-Global chemical effects of the microbiome include new bile-acid conjugations！膽酸的新發現！
在進入正題之前，我們先簡單瞭解一下膽酸的相關資訊
1. 膽酸的分類
膽酸的分類可以依“來源”和“結構”來區分
・來源：
(1) 初級膽酸 (Primary bile acids)：由肝細胞直接利用膽固醇 (Cholesterol)合成而來的為初級膽酸，例如Cholic acid (CA)和Chenodeoxycholic acid (CDCA)。
(2) 次級膽酸 (Secondary bile acids)：結合型初級膽酸經由腸道微生物水解修飾而產生次級膽酸，例如Lithocholic acid (LCA)和Deoxycholic acid (DCA)。
・結構：
(1) 結合型膽酸 (Conjugated bile acid)：在肝臟中的初級膽酸通常會和Taurine 或Glycine結合形成結合型膽酸 (也會和其他基團結合，但多與前述的兩者結合)。
(2) 游離型膽酸 (Free/Deconjugated bile acid)：包括未接上基團的初級膽酸，以及在腸道被腸道菌去基團(Deconjugated)的膽酸。
2. 膽酸的功能
肝臟為了清除膽固醇而利用膽固醇合成膽酸，膽酸再經過修飾後，結合型膽酸會釋放到腸道內進行脂質的乳化。人體一天所能生產的膽酸含量無法滿足腸道乳化脂質的需求，因此排出的95%膽酸會再經過腸道主動吸收回，而未被吸收的膽酸在經過微生物的修飾後形成次級膽酸最後在腸道被動吸收回到肝臟再利用，完成所謂的肝腸循環。
3. 膽酸與微生物
上述有提到，次級膽酸是初級膽酸釋放到腸道後，藉由腸道微生物修飾而得。那腸道菌到底是怎麼進行修飾的呢？
目前已經腸道菌修飾膽酸的方式有4種
(1) 脫羥基 (Dehydroxylation)：使化合物失去OH
(2) 脫水 (Dehydration)：使化合物失去H2O
(3) 差向異構 (Epimerization)：對膽酸的膽固醇骨架進行差向異構的修飾，所謂的差向異構是指在同樣的分子結構中，只有一個不對稱原子構型，舉例如下，以D-glucose和D-mannose為例，兩者的分子結構基本上是雷同的，只有紅框的地方不同，而這樣的分子變化就稱為差向異購。
圖片來源：WIKIMEDIA COMMONS
(4) 去結合(Deconjugation)：使結合型膽酸脫去Taurine 或Glycine.
可以發現上述四種都是發生氧化反應，目前已知的膽酸修飾方法大多是“分解反應”為主，而這次分享的文章中，最新發現到第五種膽酸修飾方法“合成反應“而這種新型的膽酸也是本篇的看點之一！
4. 膽酸與FXR
Farnesoid X receptor (FXR) 在整個膽固醇和膽酸的生合成步驟中扮演重要的調控角色，不同的膽酸能對FXR調控路徑產生刺激或拮抗作用。FXR在肝臟和腸道有較高的表現，而FXR參與在膽酸的生合成、運輸、分泌、吸收和脂質代謝，詳細的調控機制可以參考文獻[2]。
以下簡單的說明文獻中有提到的FXR與膽酸的相關基因作用。
FXR與其Agonistic ligand結合後，活化FXR調控下游的兩條路徑，分別可活化Fgf15和Shp (Nr0b2)基因，而這兩條路徑會負回饋膽汁酸的合成反應，也就是抑制膽酸生合成相關基因Cyp7a1和Cyp8b1。
有以上基本的概念後，就可以來看看新膽酸是怎麼被發現！
新的膽酸是怎麼被發現的？
作者的目的是想要了解微生物的代謝物質是如何影響宿主，因此首先針對實驗小鼠(有菌鼠SPF和無菌鼠GF)建構其各器官部位的菌群(16S sequencing)和代謝物(LC-MS/MS analysis, profiling)的First principal coordinate analysis (PCoA) 3D建模。可見下圖，顏色越接近紅色，表示該菌群/物質在兩種小鼠中的差異越大。在該圖中可知，腸道內菌群和代謝物是主要在兩種小鼠中差異較大的地方。
針對這些被鑑定到的代謝物質，分析哪些是在SPF鼠和GF鼠獨有的代謝物(下圖b)，並利用GNPS化合物資料庫做鑑定和分類(下圖c)。可見下圖(c) GF鼠腸道內多為醣類物質，來自於植物的天然物(Soyasaponins)和初級膽酸(Taurocholic acids)，在SPF鼠內腸道的醣類物質少可能還微生物代謝有關，SPF中也可見次級膽酸的含量較高。
接著針對腸道內的代謝物，利用Meta-mass shift chemical profiling分析這些化合物質在進行質譜分析時有失去(mass loss)或得到(mass gain)特定的修飾基團 (如下圖)，可見mass gain的物質較少。其中發現一群未知的化合物是mass gain特別的C4H8基團，且其中18.2%和結合型膽酸Glycocholic acid (GCA)有關，並且主要發現於SPF鼠的空腸(Jejunum)和迴腸(ileum)。
相較於GF鼠，SPF的腸道中，除了宿主本身可以生成的與Taurine 或Glycine結合的膽酸，還存在其他結合型的膽酸，再次可知微生物有參與再這些膽酸的生合成過程。為了驗證新的膽酸的存在，在根據質譜分析其結構後，生成其中3個新膽酸的標準品 (化合物結構和Meta-mass shift chemical profiling結果請見下圖)，分別為Phenylalanocholic acid (Phe-chol), Tyrosocholic acid (Tyr-chol) 和 Leucocholic acid (Leu-chol)，並進行Targeted分析。將標準品得到的質譜結果與SPF鼠檢體檢測的質譜結果比對，驗證這些新膽酸的存在。
作者也同時分析在SPF中宿主生成的結合型膽酸(Taurocholic acid和Glycocholic acid)和3個新膽酸在腸道中的分佈，可以發現這三個膽酸主要集中在十二指腸(Duodenum)、空腸(Jejunum)和迴腸(ileum)，見下圖(n=4)。
新膽酸真的是微生物合成的嗎？
(1) 從過往的文獻中尋找：本篇開發了一個質譜數據搜尋軟體，搜尋公開在GNPS資料庫的數據。在一篇研究微生物與肝癌的結果中，搜尋新膽酸，並比較餵食正常飲食和高脂飲食小鼠，在有或沒有處理抗生素的膽酸含量與表現，結果見下圖b，食用高脂的有菌鼠有較高的新膽酸表現，抗生素處理的小鼠則沒有新膽酸的表現。
(2) 微生物培養驗證 (in vitro)：在進行菌群與代謝物分析時，發現在餵食高脂飲食的小鼠中，梭菌屬 (Clostridium)與新膽酸的含量有較高的關聯性。因此培養了20個在人體腸道內發現的梭菌菌種培養於糞便培養基內 (Faecal culture medium)，並加入結合用的氨基酸和膽酸的前驅物，並檢測其含量，發現有兩株菌種Clostridium bolteae strains WAL-14578 和 CC43001B可以生成Phe-chol和Try-chol 。
作者更近一步使用WAL-14578培養於糞便培養基中並添加帶有同位素標記的13C-Phenylalanine，最終檢測到帶同位素的Phe-chol含量，結果中可見下圖。
(3) 小鼠驗證 (in vivo)：作者餵食小鼠帶有13C-Phenylalanine的高脂飲食，結果如下圖，在小鼠的糞便中確實有檢測到帶有同位素標定的Phe-chol。
人類身上有這些新膽酸嗎？
在探討微生物與宿主關係時，使用模式動物會遇到的問題是，這些機制是否能套用在人類上？為了驗證這個觀點，作者利用MASST搜尋了1,004篇發表在GNPS的文獻數據，其中28篇研究比對到3個新膽酸。作者更在American gut project的數據中，發現1.6%的人類糞便檢體內至少有一種新膽酸的存在。
在分析這些人類腸道代謝物數據時，更發現這些新膽酸在患有發炎性腸道疾病 (Inflammatory bowel disease, IBD)和囊狀纖維化 (Cystic fibrosis, CF)的含量相較於健康人高，可見下圖。
*補充：Cystic fibrosis患者會有胰腺脂肪酶 (pancreatic lipase)不足、腸道微生物絮亂與腸道脂肪堆積的症狀。
另外在前一段描述in vitro的實驗中，可以看到作者是使用在人類腸道有發現的菌種來進行實驗。除了上述的實驗，作者在文獻中都有針對這些數據做更多的分析與驗證，以證實新膽酸確實在人類中有關，也與人類的腸道菌群有關。
新膽酸是否參與人體膽酸的調控？
作者為什麼會想要探討新膽酸是否會參與人體調控路徑呢？還記得in vitro的培養基實驗所使用的菌種Clostridium bolteae (C. bolteae)嗎？在先前的研究指出C. bolteae為一種Bile-resistant的菌種，在小鼠的腸道中發現C. bolteae產生膽酸會影響腸道內菌群間的作用，但在Human fecal culture medium中添加新膽酸後，菌群結構卻沒有顯著的影響(結果請見文獻中Extended figure. 8c)。因此作者想了解究竟新膽酸在人體腸道內的功能是什麼？是否參與人體膽酸的調控機制？
為此設計了Luciferase reporter assay, 利用人類HEK293細胞來進行驗證。結果如下圖，發現Phe-chol和Tyr-chol對人類FXR是強的活化物。
作者後續灌食小鼠新膽酸，並檢測腸道與肝臟內參與膽酸生合成的相關基因表現，結果如下圖。從上面的細胞實驗可知Phe-chol和Tyr-chol可以活化FXR，因此會提升腸道內Fgf15和Shp基因的表現，並抑制下游膽酸生成基因Cyp8b1和Cyp7a1的表現。
*補充：圖中Corn oil為negative control；GW4604為人工合成的物質，為FXR的ligand；作為Positive control.
以上實驗驗證新膽酸能刺激人類FXR，並且在小鼠實驗中驗證新膽酸在激活FXR後能啟動與影響下游相關基因的表現。至於新膽酸對於人體的健康和FXR相關疾病是否有關連，還須待進一步的探討。
最後總結本篇的重點
首先本篇揭示了在小鼠中，各器官化合物會被微生物所影響，尤其是在腸道的部分。腸道微生物已知主要進行分解作用居多，但在本篇結果卻發現了第五種微生物膽酸修飾方法-合成作用。作者更近一步利用MASST軟體分析過往文獻，並實驗驗證新膽酸存在於小鼠和人體內，也發現新膽酸能活化FXR，啟動下游膽酸生合成基因。
參考文獻：
[1] Quinn, R. A., Melnik, A. V., Vrbanac, A., Fu, T., Patras, K. A., Christy, M. P., ... & Downes, M. (2020). Global chemical effects of the microbiome include new bile-acid conjugations. Nature, 579(7797), 123-129.
[2] Liu, T., Song, X., Khan, S., Li, Y., Guo, Z., Li, C., ... & Cao, H. (2020). The gut microbiota at the intersection of bile acids and intestinal carcinogenesis: An old story, yet mesmerizing. International journal of cancer, 146(7), 1780-1790.
要了解更多實驗設計細節，可以參考文獻[1]，膽酸相關的知識可以上網搜尋了解更多或參考文獻[2]。圖爾思提供46種膽酸的絕對定量檢測服務，欲了解更多，請與我們洽詢喔！
