【Metagenome小學堂】我該採取什麼策略進行 Metagenome 分析?

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好的 Metagenome 結果不只需要好的樣品和定序品質，強大的生物資訊分析更是不可或缺，如何有效從序得到的短讀⻑序列中拼湊出微生物的正確樣貌，進而了解菌相組成與其中的愛恨糾葛，首要工作是選用適當的分析流程。

想像一下，如果每個物種都代表一個完整的拼圖，每個樣品就像是一大袋裝滿拼圖的袋子，定序數據就像是從袋子取出一堆來自不同組的拼圖，生物資訊分析就像是組裝拼圖、企圖還原袋中內容物的過程。就像拼拼圖採取不同策略一樣，目前 Metagenome 分析方法主要分為兩大類：基於參考基因組資料庫的分析 (reference-based analysis) 和基於序列組裝的分析 (assembly-based analysis)。

|| Reference-based analysis

Reference-based analysis 將序列與已建立的微生物基因體資料庫進行比對，進而快速得到與資料庫相符的物種與功能註釋等資訊，此類方法分析速率較高，但會受限於資料庫的完整性和正確性，若資料庫不夠完善，可能會遺漏新物種，對新基因的研究能力也較低。以拼圖為比喻，資料庫就好像是一些已知拼圖的外框，使用這些外框來拼拼圖的速度會比直接組裝來的快，也有機會使用較低的定序資源來進行分析。

分析流程在移除宿主基因體後，透過 MetaPhlAn 將序列比對 ChocoPhlAn 資料庫，ChocoPhlAn 是經過專門優化的資料庫，從約 100 萬微生物基因體中識別出約 510 萬個 SGB（Species-levelGenome Bins）標記基因（marker genes），藉由序列比對和標準化計算估算人類或小鼠樣品的微生物菌相組成。

|| Assembly-based analysis 

Assembly-based analysis 不需依賴已知的參考基因組，直接將序列組裝成較⻑的片段 (contigs) ，再進行基因預測、分類和註釋等後續分析，可以更全面地分析樣本中的組成與訊息，有較高的機會發現新物種或新基因，適合探索性研究但十分依賴組裝正確度，相較於 Reference-based analysis 使用的計算資源龐大，資料分析也更為複雜，同時需要足夠的序列進行組裝，較高的定序深度可以增加組裝的連續性和準確性，得到更完整的結果。

組裝流程在組裝後會依照序列特徵進行分群 (Binning)，就像是在拼圖初步組裝後依照顏色進行分類一樣，序列特徵包含像是四碼核酸頻率、定序深度、覆蓋分布、GC 含量或關鍵基因種類，依照這些特徵可以將不同整類基因體進行分群，後續再依分群結果進行資料庫比對，此法就不受資料庫的限制，有機會找到新物種或新基因。

|| 我該使用什麼方法