08 2022．06

Oxford Nanopore 2022 London Calling 最新進展統整

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有在追蹤 Nanopore 進展的各位一定知道，就在五月底 Nanopore 剛剛結束了一年一度的 London Calling 大會，現在就讓我們一起來看看今年 Nanopore 端出了什麼樣的大菜吧！

摘要

首席技術官 Clive Brown 及其同事 James Clarke、Stuart Reid、Lakmal Jayasinghe 和 Rosemary Sinclair Dokos 在會議中向大家展示了 Nanopore 技術的最新更新，會議中提到 Nanopore 現在可以以高產量提供非常準確、全面的數據產出，也能夠即時對短片段或長片段進行定序，同時還分享了單個氨基酸識別的早期數據。

會議亮點

推出“兩全其美”的定序化學試劑，結合最新的 R10.4.1 定序晶片與最新的 Kit14，提供高準確度且高產出的定序結果，其單分子原始讀長單股數據準確度達到 99.6%，雙股數據為 99.92%。更令人驚豔的是可以藉由調整定序環境條件提供進一步的靈活性和最佳化調整。
在用戶於 R10.4.1 和 Kit14 過渡期間，將繼續提供目前的 R9 定序晶片和 Kit10/Kit11。
將進行高產出、經濟實惠、手掌大小的 PromethION 2 (P2) 定序儀發貨。
藉由 Remora 等甲基化分析工具的發展，Nanopore 將提供最全面化的甲基化分析。
短片段定序在 Nanopore 平台上的應用實例: 包括cfDNA的甲基化和核醣體分析。
新的定序文件格式— pod5，旨在取代 fast5，可實現更快的寫入/讀取速度。帶來更高的數據產出和準確度，使原始數據文件更小並簡化下游分析流程。
分享在 Nanopore 平台上進行單個氨基酸識別的早期數據。

準確度和數據產出

Oxford Nanopore R10.4 晶片系列搭配本季最新推出的 Kit14 試劑，提供高彈性的準確度與數據量。

現在可以透過改變運行溫度來調整不同化學試劑產出，溫度條件可以在 Nanopore 軟體中進行編輯，目前提供三種模式提供選擇：260 bps（準確模式），400 bps（默認模式），520 bps（產出模式）。
三種模式的原始讀長準確度分別為：99.6%（準確模式），99.2%（默認模式），99%（產出模式）

三種模式的雙鏈準確度分別為：Q31（準確模式），Q30（默認模式），Q29（產出模式）

Oxford Nanopore 團隊使用產出模式（520 bps），在單個 PromethION 定序晶片上得到了 307Gb 的數據產出。

最新的化學試劑數據分享：人類參考基因體完美比對的最長雙鏈讀長為 72 Kb，最長的 Q40 read 為 144 Kb。

技術平台與設備

本持著 Oxford Nanopore “任何人、在任何地方進行DNA定序”的理念，Nanopore 推出的手持式、低成本、超高通量 DNA 定序設備—— PromethION 2 (P2) 已經出貨完成，這台新設備在一次定序中能產生多達 580Gb 的序列數據。

另外，Nanopore 發表了開發中 MinION Mk1D 的介紹。這是為平板電腦設備設計的帶有定序儀的配件鍵盤，代表著使用者可以簡單地將推薦規格的平板電腦插入 MinION Mk1D 配對即可開始定序。

Nanopore 定序平台針對多方面進行改進，包括定序晶片的設計、更低的樣本量需求、定序晶片上膜的改進、樣本/建庫流程的整合、藉由免除晶片沖洗而延長定序時間，以及製造工藝上的改進等，推動全系列產品品質的提升。

新的低雜訊、低功耗 ASIC 開發中，原型將在 Q4 完成。
新一代“Rx”系列，具有比R10還長的 reader head，目標為提升均聚物 (Homopolymer) 定序準確度，目前單鏈準確度為 98%，比起 2021 年 12 月的數據已提升了 8%；該系列目前仍在持續開發中。
推出新的 basecaller ——Dorado，可加快存取速度、支持 Apple GPU 和新的 NVIDIA 硬體。預計還能與 PromethION 48 高準確度（HAC）模型相容。
Adaptive sampling，新發布測試版本可用於 PromethION 和 MinION Mk1C，且在之後發布完整版本。

即時甲基化分析

Nanopore 平台若為不經過擴增的 DNA/RNA 定序，可在獲得核苷酸序列的同時獲得有關鹼基修飾的訊息。最近發布的 Remora 是 Oxford Nanopore 最新的甲基化分析工具，進一步加強了設備上的鹼基修飾分析。Remora 已併入 MinKNOW 中，從而能夠更簡單地獲得即時甲基化數據。其在 CpG 背景下對 5mC 的識別檢測準確度達到 99.8%。

迎向任何長度DNA/RNA定序

Oxford Nanopore 可對任何長度的 DNA 或 RNA 分子進行定序，從短片段到超長片段。是目前定序市場上唯一能夠以單一技術對橫跨五個數量級的 DNA 長度進行定序的技術。

新推出的短片段模式（SFM）現在已經可以在 MinKNOW 上使用，可在短至 20 個鹼基的片段進行定序。

實例分享：Oxford Nanopore 在 PromethION 平台上完成人類樣品定序，產出 > 2.5 億條無擴增之序列，平均讀長長度約為 200 個鹼基。SFM 具有多種潛在用途、大規模、較低成本，保留甲基化資訊等優勢。

試劑更新

Kit14 將併於 Oxford Nanopore ligation kits 中推出，其中的 native barcoding kits 將於未來擴充至 384 barcode (開發中)。此外，快速定序試劑組系列也會進行升級，目標為達到 Q20+ 的準確度，且維持 10 分鐘的簡單建庫流程。
短片段去除試劑組：該試劑可移除長片段建庫應用中的短片段核酸，預計於 6 月可搶先體驗。
Ultra-long DNA Sequencing Kits 計畫升級為 Kit14 化學試劑 (開發中)。
cDNA sequencing kits: 新的 adapter 設計可以在 PromethION 上提供 > 160M 條序列; 在 MinION 上提供 > 20M 條讀長，可應用於轉錄體分析上的全長轉錄本、轉錄本表達分析、基因融合、異構體發現、細胞亞型、單細胞空間基因體學等。其中單細胞分析流程已發佈於 Github。
減少直接 RNA 定序的 DNA 起始量，poly(A) RNA 起始量由 500 ng 降至 50 ng ; total RNA 起始量由 2µg 降至 500 ng。

蛋白質分析

Oxford Nanopore 研發團隊釋出於 MinION 上測試胺基酸訊號的早期數據結果，未來將進一步最佳化化學試劑，以獲得更好的蛋白質訊號，並開發分析方法來預測未知胜肽的特性。

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參考資料

1. Oxford Nanopore 2022 London Calling conference:
https://nanoporetech.com/about-us/news/oxford-nanopore-delivers-technology-update-annual-london-calling-conference-bringing

圖爾思生物科技 / 微生物體研究中心

吳雁韻文案

http://www.toolsbiotech.com/

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2022．06．08