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2021．12
【RNAseq 3小學堂】RNAseq多的是，你不知道的事
原創文章 引用請註明出處
#RNAseq #實驗設計 #雲平台 #3小學堂
|| 3分鐘速解RNAseq分析，本周RNAseq多的是，你不知道的事 ||
看完了一系列的 RNAseq 3小學堂，相信你對 RNAseq 分析結果和報告內容有了進一步的認識，你是不是躍躍欲試了呢！小編在這裡整理了幾個在過去的經驗中，一些可能會被忽略的部分，強烈建議在開始實驗之前先瀏覽本篇文章喔~
|| 條件允許的話，做生物性重複吧！ ||
NGS 定序成本的降低使得 RNAseq 的成本也在持續下降，在相同的經費下可以進行更多樣本的定序，而且目前學術研究也有越來越要求 RNAseq 進行有生物性重複的趨勢，如果經費和樣本取得沒有太大困難的話，會非常建議做 3 以上的生物學重複。
1. 生物學重複的意義在於對生物學上的不同樣本做相同的處理，減少個體差異帶來的影響，除了樣本的差異之外其餘條件應維持相同。
2. 一般而言，有生物學重複會分析結果是比較可信的，在不同次實驗間的重複性也會較好，可以得到較穩定的分析結果。
3. 在樣本間相關性分析中有提到，生物性重複不僅可以觀察整體實驗的穩定度，有必要的話可以考慮剔除離群值。
4. 無生物學重複的實驗也可以進行分析，使用的分析方法不同，如果樣本珍貴或是臨床樣本依然還是可以進行 RNAseq 分析的，但 DEGseq 在無重複樣品的統計上是以資料分佈估算推論各基因潛在的變異程度，對於單一處理基因表現的變異無法藉由實際數據觀察得知，對於實驗結果的再現性風險是比較高的。
|| 實驗設計與比較組別的設定 ||
在 RNAseq 的分析中，不論是 DEG 或是 GSEA 分析，都是兩個組別的比較，通常為處理組和對照組(Treatment v.s. Control)，在設計實驗的時候就會設定好要進行那些組合的比較。
1. 比較組合交換( A v.s.B 變成 B v.s. A) 的分析結果是相同，只有基因的上下調方向改變，因此增加這樣的組合意義不大。
2. 比較組合建議是相同類型的樣本，比如植物的根和葉就不適合放在一起比較，因為本身部位的不同就會造成 RNA 表現差異極大，Normalization 可能會受到影響。這時候會建議將根與葉拆成兩個分析專案進行。
|| 計畫做很多樣本嗎？不要忘記紀錄性狀資料 ||
|| 對圖爾思雲平台很有興趣嗎? 先確認實驗物種是否支援 ||
3小學堂的文章內，多少有提到RNAseq雲平台的功能與操作，若你有使用圖爾思雲平台的意願，那一定要確認實驗物種是否能在雲平台上操作喔~ ！
目前雲平台支援 23 個物種進行分析，未來也會陸續建置資料庫較完整的物種，建議除了常見的人類、小鼠之外，在進行實驗之前先確認是否對該物種進行支援喔！
|| RNA 品質是一切的開始 ||
RNA 的品質可能會影響到最終的結果，比如：RNA 的降解會導致分析的偏差，進而影響最後的結論，因此獲得高品質的RNA是重要關鍵。
推薦文章：如何獲得高品質的RNA？RNAseq 3小學堂，未來有緣再相見！
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圖爾思生物科技/微生物體研究中心
顏維萱/沈筱凌
顏維萱/沈筱凌
