PCR理論、應用與演進

1985年當PCR技術首次登上分子生物學的舞台，PCR技術就開始以巨大的力量對於分子生物學的發展產生影響，PCR技術的高敏感度、高效率、應用範圍之廣、技術簡便易上手等都是至今歷久不衰的原因之一，發展至今PCR技術早以廣泛的應用於生命科學、醫療診斷、法醫學領域、食品安全與環境檢測等領域之中。

PCR全名為Polymerase Chain Reaction，作用原理為利用兩條primer加上耐熱的DNA polymerase(Taq)在反覆的溫度改變下將少量的DNA進行擴增。因此於PCR反應中的基本成分為:

1. DNA 模版(template)
2. 一對primer
3. DNA polymerase(Taq)
4. dNTP
5. 鎂離子緩衝液

隨著生物技術的快速演進，PCR技術也已經針對科學家的不同需求發展出基於PCR原理的各式各樣生物技術，其中最常見的包括：Quantitative PCR(qPCR)、muliplex PCR、ddPCR等。其中qPCR的應用範圍最為廣泛，因此圖爾思就先針對qPCR跟大家介紹其原理與相關應用。

Quantitative PCR(qPCR)又稱為 real-time PCR 是一種在PCR過程中以螢光染劑或是螢光標記的probe偵測經過PCR反應產生的產物，然後經過光學儀器的偵測並經過數學統計計算出樣品DNA(cDNA)含量的一種定量方式。相較於傳統PCR定性的偵測，qPCR更可以做到定量的偵測，且非常非常精準。

通常qPCR的定量方式可分為 SYBR 與 TagMan 系統兩種：
1. SYBR系統：
SYBR是一種帶有綠色螢光的染劑，游離的SYBR本身並不會發出螢光，只有當SYBR與雙股DNA結合時才會發出綠色螢光，當SYBR發出的綠色螢光被機器偵測後，軟體就會演算出樣品起始的DNA含量，但由於SYBR並不具有專一性，所以反應過程中的primer dimer 和非目標DNA產物都會影響產出的數據，所以SYBR比較適合樣品量較少且對於專一性要求不高的客戶。近來，SYBR染劑也演化出第二代的產品-EVA Grenn，此種染劑能提供比SYBR更高的專一性。

2.TagMan系統：此系統最核心的組成份就是probe，TagMan系統的probe是單股DNA，其5'端接上發光基團(fluorophore)，3'端則是接上吸收基團(quencher)，游離的probe無法被機器偵測到螢光訊號，因為Probe上發光基團和吸收基團距離很近，因此probe發光基團發出的螢光會被吸收基團吸收，而唯有當probe被水解時，發光基團和吸收基團就會被分開，probe發出的螢光才會被機器吸收進而進行後續的分析演算而得到樣品起始DNA的定量。qPCR反應開始時，雙股DNA經過高溫會分解成單股DNA，此時probe就會和特定序列的單股DNA結合，接著在Taq的擴增過程中(elongation)，Taq的5'-->3'外切脢的活性會將probe從5'端開始把probe切除，此時發光基團就會和吸收基團分開了，由於probe具有序列的專一性，因此每擴增一條DNA就會產生一個螢光分子，螢光訊號就會和PCR產物的形成是同步並累加的。也因為probe具有對於序列的專一性，因此在同一個反應中我們可以加入多條偵測不同目標序列的probe而達到同時檢測不同基因的目的。

從上面兩種主流方法的介紹中，絕大多數科研會選擇較便宜的SYBR系統進行研究，而再需求更高的醫療診斷或是基因檢測領域，TagMan系統才是唯一的選擇。因此在認識這兩種方法後我們可以整理出其相對應的應用供大家未來在選擇系統時的一個參考依據：

1. SYBR系統應用範圍: SNP、點突變基因檢測、基因突變檢測...
2. TagMan系統應用範圍: 免疫組學分析、臨床疾病基因檢測、病原體檢測、抗藥性分析、腫瘤基因診斷...

以上，圖爾思帶來的簡要介紹希望大家都能對於PCR應用與演進有進一步的了解。

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