【三代定序 新知分享】Homopolish_移除Nanopore定序系統性錯誤
【三代定序 新知分享】Homopolish: 移除Nanopore定序系統性錯誤的好工具
第三代定序，其定序片段從原本二代定序的300-600 bp，增加到上百個Kb，又被稱為長讀長定序。三代定序的主要廠商之一Nanopore，因其定序原理，使得超長片段定序為主要特色。近期，更有定序片段長達4Mb，以及定出目前世上最大基因體-昆士蘭肺魚基因體等突破。然而，該技術一直引人詬病的最大點，在於定序準確度不夠。從2014年，Nanopore公布的數據中，發現其raw reads準確度約在80%，隨著建庫試劑、奈米孔道與演算法的提升，最新數據顯示，raw reads準確度可達99.1%。在今天的文章中，和大家分享Homopolish這個拋光打磨工具，可以使得細菌基因體達到Q50，甚至更高的準確度!
【Homopolish】
這篇文獻中使用幾種不同的校正工具。Racon藉由partial order alignment (POA) with vectorization；Medak基於bidirectional long-short-term memory (LSTM) trained。而Homopolish技術為support vector machine (SVM)-based，利用同源序列(homologous sequence)去校正Nanopore定序時產生的系統性錯誤。其流程如下圖一。
圖ㄧ
【Metagenomic dataset results】
此樣品中含7隻不同細菌，使用常見校正工具Racon+Medaka或MarginPolish+HELEN，以及Homolosh去比較定序結果的準確度(Q值)。可以從總基因體分析結果看到，使用Racon+Medaka時準確度落於Q36-38，而MarginPolish+HELEN準確度約為Q37-46。當Homopolish與Racon或MarginPolish合併使用時，其準確度可達Q38-50。若是將Homopolish加入Racon+Medaka或MarginPolish+HELEN流程時，三個校正工具的使用下，準確度上升至Q40-90，如下圖二。
圖二
此外，本篇研究中發現，利用Racon或MarginPolish在檢測細菌基因體變異時，deletion會有false detection的現象。從原始Flye產出439個deletion，經由Racon或者MagrinPolish處理後，deletion分別上升至2417和637個。而此現象可以藉由後續加入Homopolish去修正，deletion下降至120和146個，如下表一。
表一
【Bacterial isolates dataset results】
接著，作者想要測試不同校正工具在分析單菌基因體時，其效果如何。在實際應用層面上，研究常需要將舊有的數據進行重新分析。在這段篇幅中，作者也使用了舊版basecaller工具(如：Albacore)產出的單菌基因體數據，去看是否能使用Homopolish達成好的校正結果。當使用Homoploish+Racon時，其準確度可達Q26-33，較Racon+Medaka Q23-29高。有趣的是，使用HELEN作為打磨拋光工具，在此組數據上，校正效果並不好，此現象也可以在病毒基因體分析中觀察到。MagrinPolish+HELEN其準確度落於Q20-27，與先前metagenomics結果相衝突，可能是因為HELEN的訓練數據大多從單一來源ZymoBIOMICS而來。結果如圖三所示。
圖三
【R10.3 flow cell results】
Nanopore的定序孔道從R9.4演化到R10.3，其改變為R10.3在同一孔道中讀兩次序列，可以增加其定序準確度與重複序列的辨識度。在上述內容中，皆使用R9.4的數據做分析。接著，作者將R10.3 metagenomics數據進行分析，其Flye數據準確度坐落於Q28-42，的確比R9.4的Q22-26高。加入工具校正後，單使用Racon無法有效提升其準確度， Medaka使得準確度提升至Q30-50， HELEN可將準確度提升至Q40-90。若合併使用Medaka與Homopolish，可將數據準確度提升至Q33-90，證實Homopolish可以有效提升R10.3數據的準確度，如圖四。實際上，隨著basecaller的進步、演算法的優化，以及後續打磨拋光工具的應用，目前不管是R9.4或者是R10.3數據，皆可達到Q50以上的準確度。而就通量上來比較的話，R9.4是比R10.3佳的。
圖四
本篇研究中，除了將Homopolish應用於細菌基因體外，也分析了病毒(Lambda phage)與真菌(S. cerevisiae)基因體，準確度可由Q24有效提升至Q38。說明了Homopolish在小基因體組裝上，其準確度是較其他工具高的。不過，該工具在真核生物基因體上的成效尚待測試。
【原文連結】Homopolish: a method for the removal of systematic errors in nanopore sequencing by homologous polishing
https://genomebiology.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13059-021-02282-6
>了解更多三代定序服務
